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目的:扩增大鼠C型利钠肽(C-type natriuretic peptide, CNP)基因并将其构建到猫的慢病毒表达载体上,包装慢病毒并感染293细胞和小梁细胞(NTM5),检测其在 mRNA水平的表达及其引起细胞内环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)浓度的改变,探讨CNP基因治疗降眼压的可能机制。 方法:从Norway大鼠肾脏组织的cDNA中扩增出大鼠CNP的全长编码序列,将其构建到猫的慢病毒表达载体 pCDF1-MCS2-EF1-copGFP并做酶切和测序双重鉴定;将重组CNP质粒和空载体GFP分别与两种包装质粒pFP93和pMD2.5共转染293FT细胞进行病毒包装,用两种病毒液上清分别感染293细胞和小梁细胞(NTM5),通过RT-PCR方法检测CNP在mRNA水平上的表达;通过放射性免疫方法检测CNP病毒对293细胞内cGMP水平的影响以及重组CNP质粒对NTM5细胞内cGMP的影响。 结果:成功扩增大鼠CNP基因并构建大鼠CNP基因慢病毒表达载体,测序证实大鼠CNP基因出现一个碱基的改变(G→T),但编码的氨基酸不变,仍为丙氨酸,氨基酸序列与公布的序列完全一致;RT-PCR结果显示 CNP病毒感染293细胞和NTM5细胞后较对照组GFP表达高;放射性免疫方法检测CNP病毒上清感染293细胞后cGMP浓度(pmol/ml)为:3.44±0.41(均数±标准差,n=4),GFP病毒上清感染293细胞后cGMP浓度(pmol/ml)为:2.44±0.19,两者相比差别有统计学意义(P<0.05);放射性免疫方法检测重组 CNP质粒转染 NTM5细胞后cGMP浓度(pmol/ml)为:1.96±0.13(均数±标准差,n=6),GFP转染后 cGMP浓度(pmol/ml)为:1.66±0.17,两者相比差别有统计学意义(P<0.05)。 结论:成功扩增大鼠CNP基因并构建pCDF1-MCS2-EF1-copGFP/ratCNP载体,经包装后获得了具有感染力的病毒液;RT-PCR方法证实CNP病毒上清感染普通293细胞及NTM5细胞后表达上调;放射性免疫方法检测CNP感染普通293细胞以及重组CNP质粒转染NTM5细胞后cGMP浓度较对照组明显增高。 大鼠CNP基因慢病毒表达载体的构建与鉴定为下一步开展CNP基因治疗奠定了基础;大鼠CNP的表达上和功能上的检测结果为进一步研究其降眼压机制提供依据。重组CNP将有可能成为青光眼基因治疗的有效方法。