研究背景腹膜透析是终末期肾脏病的主要替代治疗方式之一,全球大约有11%的终末期肾脏病患者需要接受腹膜透析治疗。但是长期腹膜透析治疗会导致腹膜纤维化。炎症是腹膜纤维化最关键的病理生理过程,巨噬细胞参与透析后腹膜炎症反应。目前防治腹膜纤维化主要有两大策略:一是腹腔内给药抑制纤维化进展,二是换用理化性质温和的非葡萄糖腹膜透析液。从临床转化角度看,第一种策略会增加潜在腹腔感染风险且全身作用不明确;第二种策略即便换为非葡萄糖透析液长期应用仍可能出现腹膜纤维化。因此为开发安全高效的新型腹膜透析液,寻找安全、无毒的抗纤维化物质是预防腹膜纤维化的难点。氢气是无色无味的小分子气体,可中和活性氧,发挥抗氧化抗炎症作用。据报道分子氢可以预防肾脏、肝脏、心脏和肺组织纤维化。然而分子氢对腹膜纤维化的保护机制仍未不明确,需要进一步研究。PTEN是作用于多肽和磷酸肌醇底物的磷酸酶,主要功能是催化PIP3去磷酸化,抑制PI3K/AKT/mTOR途径来控制多种细胞过程。本研究旨在探讨分子氢是否具有治疗腹膜纤维化的潜力及是否能够通过PTEN发挥其抗纤维化作用。研究目的一、明确分子氢对于改善腹膜透析相关腹膜纤维化的作用。二、探索分子氢发挥抗纤维作用的可能分子机制,为分子氢的生物学作用提供理论依据。研究方法一、动物模型与分组27只体重在22-26g之间的C57BL/6雄性小鼠被随机平均分成3组,分别是生理盐水组(Saline)、高糖腹膜透析液组(HG)和富氢高糖腹膜透析液治疗组(HGH;氢浓度为1.0-1.5mg/L)。生理盐水组小鼠腹腔注射2ml生理盐水,一天一次,连续注射28天。高糖腹膜透析液组小鼠腹腔注射4.25%高糖腹膜透析液2ml,一天一次,连续注射28天。富氢高糖腹膜透析液治疗组小鼠腹腔注射富氢高糖腹膜透析液2ml,一天一次,连续注射28天。二、组织病理染色小鼠腹膜组织取材固定后,进行石蜡包埋,切片。按照HE、Masson、免疫组织化学和组织免疫荧光的实验步骤进行染色。使用白光或荧光显微镜进行拍照。三、腹膜功能检测造模28天后,各组小鼠腹腔注射2ml生理盐水,两小时后麻醉小鼠,并打开腹腔用干燥棉球吸取未被腹膜吸收的生理盐水来间接评估小鼠腹膜功能(计算公式:吸收率=(总注射生理盐水质量-干湿棉球质量差)/总注射生理盐水质量*100%)。四、细胞培养与干预细胞采用M199培养基,10%FBS,1%双抗,37℃,5%CO2的条件进行培养。使用浓度梯度的葡萄糖(0mM、25 mM、50 mM、100 mM、150 mM、200 mM)处理MET5A细胞24h;使用含氢细胞培养箱培养MET5A细胞(培养基氢浓度0.6-0.8mg/L);细胞干预分甘露醇对照组(Mannitol)、高糖刺激组(HG)、高糖刺激加氢组(HGH)和甘露醇加氢组(MH)。五、细胞内ROS检测按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10微摩尔/升。加入到处理好的细胞当中,37℃孵育20min。使用流式细胞仪和荧光成像技术检测细胞DCF荧光强度。六、细胞线粒体膜电位检测按照试剂盒要求对待检测细胞进行JC-1染色,细胞培养箱中37℃孵育20min。利用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位。七、细胞免疫荧光使用腔室载玻片培养细胞,细胞刺激干预之后,用多聚甲醛固定2h。用0.5%TritonX-100室温打孔20min,用含5%山羊血清的PBS封闭1h。一抗4℃孵育过夜。加入荧光标记的二抗(1:500),37℃避光孵育1h。用DAPI避光孵育5min染细胞核。滴加防荧光淬灭剂之后进行封片,通过荧光显微镜观察结果并拍照。八、细胞转染(miRNA mimic)以6孔板为例进行细胞转染操作。A管125μl Opti-MEM无血清培养基中加入5ul20μM浓度的RNA mimic。B管125μl Opti-MEM无血清培养基中加入3.75μl lipo3000试剂,混匀室温放置12 min。然后将试剂加入到6孔板当中,放入细胞培养箱继续培养。九、过表达细胞株构建利用外源性接入目的基因的方式进行过表达质粒的构建。对质粒进行转化扩增与抽提之后,用慢病毒包被质粒形成过表达病毒。用过表达PTEN的慢病毒感染细胞后,使用嘌呤毒素进行细胞株抗药性筛选,RNA或蛋白进行验证后得到稳转细胞株。十、组织与细胞蛋白检测使用总蛋白提取试剂提取组织和细胞蛋白(按照1:100将PMSF、蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制加入到蛋白裂解液中)。通过BCA法测的蛋白浓度,加入蛋白上样缓冲液煮沸负20℃冰箱保存。通过western blot蛋白免疫印迹法进行组织和细胞蛋白表达水平检测。十一、组织与细胞RNA检测使用Trizol法提取组织或细胞总RNA,通过酶标仪检测RNA浓度。使用mRNA反转录试剂或者miRNA茎环法反转录试剂得到样本的cDNA,利用SYBR Green染料法对样本进行实时荧光定量PCR的检测。十二、生物信息学预测使用NCBI GEO DataSets中的数据验证PTEN表达水平,使用miRTargetLink Human网站预测PTEN相关miRNA。十三、统计学方法实验数据采用(均数±标准误)表示,应用GraphaPad 7.0软件进行统计图表绘制与统计数据分析。实验涉及到两组样本比较的,采用两独立样本t检验,实验涉及多组比较的,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。p<0.05表示组间有统计学差异。结果一、分子氢改善高糖对间皮细胞活力及氧化应激的影响(一)细胞活力检测实验CCK8结果提示分子氢可以改善高糖导致的MET-5A细胞活力的下降。(二)MET-5A细胞内ROS水平随葡萄糖浓度的升高而升高并引起线粒体膜电位的下降,分子氢能够抑制葡萄糖诱导产生的ROS,并且通过上调线粒体膜电位改善线粒体功能。二、分子氢抑制高糖诱导腹膜间皮细胞EMT与纤维化(一)通过定量PCR和细胞免疫荧光实验发现分子氢在mRNA和蛋白水平能够抑制高糖诱导MET-5A间皮细胞EMT,表现为抑制上皮指标E-cadherin的丢失和间质指标Vimentin的增加。(二)通过组织蛋白印迹和免疫荧光实验提示高糖腹膜透析液能够引起小鼠腹膜间皮细胞发生EMT改变(E-cadherin下降,Vimentin升高),而分子氢治疗能够上调E-cadherin、下调Vimentin的表达抑制小鼠腹膜EMT改变。(三)细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹实验结果显示分子氢能够在体外抑制MET-5A细胞在高糖刺激后纤维化指标FN表达增加的现象。(四)小鼠腹膜组织病理结果提示高糖腹膜透析液处理后的小鼠腹膜厚度明显增加,且纤维化相关指标FN、α-SMA和MMP1显著高表达,分子氢治疗组小鼠腹膜厚度及FN、α-SMA和MMP1的表达显著减少。同时小鼠腹膜功能实验显示分子氢能够改善高糖诱导的小鼠腹膜功能的下降。三、PTEN介导腹膜纤维化且与高糖诱导ROS产生有关(一)通过NCBI GEO数据库检索发现GSE62928编号数据样本为腹膜透析患者腹膜组织,数据提示PTEN在发生包裹性硬化的腹膜组织中低表达。同时利用蛋白免疫印迹的方法检测腹膜超滤衰竭患者和对照患者腹膜组织中PTEN的表达水平,发现超滤衰竭患者腹膜组织中的PTEN表达低于对照患者。(二)通过蛋白免疫印迹实验发现PTEN表达随葡萄糖浓度的升高而下降具有剂量依赖性,同时ROS诱导剂过氧化氢诱导PTEN下降也有剂量效应关系。为明确ROS在高糖诱导PTEN下调中的作用,使用NAC清除高糖刺激后产生的ROS,发现清除ROS后PTEN表达上调。四、高糖通过PTEN激活PI3K/AKT/mTOR通路诱导纤维化发生且分子氢可以抑制这一过程(一)高糖刺激MET-5A细胞后,PI3K/AKT/mTOR通路激活,Vimentin表达升高。PTEN是该通路上游的调控因子,通过过表达PTEN能够有效抑制高糖诱导mTOR活化,进而抑制了Vimentin表达。(二)蛋白免疫印迹实验显示分子氢干预后,被高糖激活的PI3K/AKT/mTOR通路能够被分子氢所抑制,进而抑制了下游活化的Smad蛋白。五、miR-718介导分子氢上调PTEN抑制高糖诱导的腹膜纤维化(一)通过miRTargetLink Human网站寻找到123个与PTEN相关联的miRNA,其中有51个强关联。选择强相关miRNA进行下一步验证发现miR-718在细胞、小鼠腹膜纤维化模型和人纤维化腹膜组织中高表达,同时细胞和动物模型中发现分子氢能够回调高糖引起的miR-718的上调。(二)高糖环境培养的MET-5A细胞转染miR-718 mimic后,PTEN表达水平进一步下调,PI3K/AKT/mTOR通路进一步被激活,纤粘蛋白FN表达增加。同时分子氢在细胞转染miR-718 mimic后同样抑制了PI3K/AKT/mTOR激活与FN的表达。结论一、分子氢能够有效缓解腹膜透析相关腹膜纤维化,改善腹膜功能。二、分子氢的抗纤维化作用可能是通过清除ROS抑制miR-718上调PTEN抑制PI3K/AKT/mTOR途径实现的。