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1.目的寻找女性Wilson病伴生殖系统损害的中医证候分布特征;观察补肾化痰祛瘀方对Wilson病女性患者伴生殖系统损害的临床疗效;并通过动物实验进一步探讨补肾化痰祛瘀方对改善女性Wilson病伴生殖系统损害的作用机制。2.方法2.1证候调查对2017年1月至11月在安徽中医药大学第一附属医院(安徽省中医院)就诊的女性患者,完善相关检查后按就诊顺序筛选出肝豆状核变性(WD)组143例,伴生殖系统损害的肝豆状核变性组105例。统一收集符合入组标准患者的中医症状和体征资料。2.2临床研究对2017年1月至11月在安徽中医药大学第一附属医院脑病科就诊的伴有生殖系统损害的Wilson病女性患者50例;将纳入的患者随机分为治疗组25例和对照组25例。对照组治疗予以西药保肝排铜,治疗组在上述保肝排铜的基础上,加用具有补肾化痰祛瘀作用的中药方。观察两组患者证候积分变化及生殖系统损害症状改善情况。2.3实验研究将120只C57雌性小鼠经过适应性喂养1周后随机分为6组:空白组、铜负荷模型组、二巯丁二酸(DMSA)组、肝豆灵组、补肾化痰祛瘀方组、补肾化痰祛瘀方+DMSA组,每组20只。小鼠给药剂量按体表面积换算法,与成人每日服用剂量换算比值约为1:9。各组小鼠每日上午按剂量:0.2ml溶液/10g体重给予灌胃1次,予以等体积的生理盐水灌胃空白组。溶液配制:铜浓度100mg/kg体重。治疗用药从给铜的第15天开始,每日下午按剂量灌胃1次。分别予以等体积的生理盐水灌胃空白组与铜负荷模型组。持续用药到给铜第28天。通过HE染色观察小鼠卵泡的病理改变;观察各组小鼠卵丘复合物超微结构改变;将卵巢所排出的卵子取出,计算比较各组小鼠排卵的数目差异并经免疫荧光染色检测小鼠卵丘复合物颗粒细胞Ki67表达水平来观察颗粒细胞增殖。3结果3.1受试者中医证候分布率、积分、复合证候及危险度研究3.1.1两组受试者中医证候要素分布情况生殖异常组痰湿、血瘀、肾阴虚、肾阳虚分布率显著高于WD组(P<0.05);WD组火热、气虚、阳亢分布率明显高于生殖异常组(P<0.05或P<0.01);气郁、血虚、肝阴虚、脾阳虚分布率差异不具有统计学意义(P>0.05)3.1.2两组受试者中医证候积分比较生殖异常组痰湿、血瘀、肾阴虚、肾阳虚中医证候积分明显高于WD组(P<0.01);WD组火热、肝阴虚中医证候积分高于生殖异常组(P<0.01);气郁、气虚、血虚、阳亢、脾阳虚中医证候积分差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.1.3两组受试者复合证候分布比较生殖异常组多个证候所占比例大于WD组(P<0.01);WD组单个证候所占比例大于生殖异常组(P<0.01);两个证候所占比例差异两组之间无统计学意义(P>0.05)。3.1.4中医证候对Wilson病伴生殖系统损害的危险度研究用Logistic回归分析法研究各中医证候对于Wilson病生殖系统损害的危险度,痰湿、血瘀、肾阴虚、肾阳虚回归系数分别为8.629、4.496、3.829和13.684,并且均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。3.2患者证候积分变化及生殖系统损害症状改善情况治疗组和对照组患者治疗后中医证候积分值均较治疗前明显下降(P<0.01);两组治疗后相比,中医证候积分治疗组较对照组下降更明显,并且具有统计学意义(P<0.01)。有效率比较,治疗组与对照组差异有统计学意义(P<0.01)。3.3实验研究结果3.3.1补肾化痰祛瘀方对铜负荷小鼠促排后排卵的影响铜负荷组与空白组比较,促排后小鼠排出的卵子数目减少明显,差异有统计意义(P<0.01);补肾化痰祛瘀方组与铜负荷组比较,排出的卵子数目增加,差异有统计学意义(P<0.01);补肾化痰祛瘀方组与肝豆灵组比较,排出的卵子数目增加,差异有统计学意义(P<0.01);与DMSA组比较,补肾化痰祛瘀方+DMSA组排出的卵子数目增加,差异有统计学意义(P<0.01)。3.3.2补肾化痰祛瘀方对铜负荷小鼠卵泡发育的影响与空白组相比,铜负荷组小鼠卵巢内正常次级卵泡、正常窦卵泡数目均减少明显(P<0.01);与铜负荷模型组相比,补肾化痰祛瘀方组可显著增加正常窦卵泡及正常次级卵泡数目(P<0.01);与肝豆灵组比较,补肾化痰祛瘀方组可显著增加正常窦卵泡及正常次级卵泡数目(P<0.05);与DMSA组比较,补肾化痰祛瘀方+DMSA组可显著增加正常窦卵泡及正常次级卵泡数目(P<0.05)。3.3.3补肾化痰祛瘀方对铜负荷小鼠卵丘复合物超微结构的影响与空白组比较,铜负荷组小鼠卵丘复合物内异常变性的线粒体数目显著增加(P<0.01);与铜负荷组相比,补肾化痰祛瘀方组正常线粒体显著增加、异常变性线粒体明显减少(P<0.01);与肝豆灵组比较,补肾化痰祛瘀方组可增加正常线粒体数目(P<0.01);与DMSA组比较,补肾化痰祛瘀方+DMSA组正常线粒体明显增加、异常变性线粒体减少(P<0.01)。3.3.4补肾化痰祛瘀方对铜负荷小鼠卵丘复合物颗粒细胞增殖的影响与空白组比较,铜负荷模型组小鼠卵丘复合物Ki67蛋白表达水平下降明显(P<0.01);与铜负荷相比,补肾化痰祛瘀方组小鼠Ki67蛋白表达水平增加明显(P<0.01);与肝豆灵组比较,补肾化痰祛瘀方组小鼠Ki67蛋白表达水平增加(P<0.01);与DMSA组比较,补肾化痰祛瘀方+DMSA组可显著增加Ki67蛋白表达水平(P<0.01)。4.结论4.1痰湿、血瘀、肾阴虚、肾阳虚是Wilson病生殖系统损害的主要证候组成部分;4.2痰湿、血瘀、肾阴虚、肾阳虚是Wilson病生殖系统损害的主要危险因素;4.3补肾化痰祛瘀方能够明显改善女性Wilson病伴生殖系统损害患者的证候积分,显著有效改善患者临床症状;4.4铜负荷小鼠出现卵母细胞发育障碍,影响了卵泡的发育和成熟;补肾化痰祛瘀方能够使铜负荷小鼠卵泡的发育及成熟得到改善;4.5铜负荷可导致卵丘复合物颗粒细胞凋亡,同时卵丘复合物颗粒细胞的增殖能力下降;补肾化痰祛瘀方能够在抑制铜负荷小鼠卵丘复合物颗粒细胞凋亡的同时,提高其卵丘复合物颗粒细胞的增殖能力。