椎间盘退变性疾病(degenerative disc disease，DDD)是以椎间盘变性、椎体力学性能异常为始发因素的一个连续过程。由椎间盘退变而致的下腰痛(Low back pain，LBP)是现代社会中的一个常见问题。我国人口众多，且社会老龄化逐年加剧，重视退变性椎间盘疾病的研究与治疗具有重要意义。 引起椎间盘退变的原因是多方面、多层次的。目前，越来越多的研究发现细胞凋亡在椎间盘的衰老和退变中起重要作用，而Fas/FasL系统可能是椎间盘细胞主要的凋亡途径。因此打断Fas/FasL系统，减少椎间盘细胞的凋亡有望成为阻止椎间盘退变的手段。利用RNAi手段可以特异性地抑制相应基因序列的表达，从而有望达到阻断细胞的凋亡的目的。但有关的利用RNAi手段阻断椎间盘细胞凋亡的研究未见报道。 本实验设计并合成针对SD大鼠Fas基因的siRNA，转染椎间盘细胞并与FasL(Fas Ligand)共培养，观察经Fas-siRNA转染的椎间盘细胞Fas基因和蛋白表达水平及细胞凋亡的变化，探讨能否利用RNAi手段阻断椎间盘细胞凋亡。 第一部分：SD大鼠腰椎间盘细胞的培养效率 目的：探讨SD大鼠腰椎间盘内层纤维环+纤维环与髓核交界区细胞的培养方法。 方法：用酶消化法分离培养SD大鼠腰椎间盘内层纤维环+纤维环与髓核交界区细胞，经倒置显微镜观察、甲苯胺蓝、番红O染色和胶原Ⅱ免疫组化鉴定确定培养细胞类型。 结果：培养的椎间盘细胞经鉴定为类软骨细胞。 结论：用酶消化法可成功培养大鼠腰椎间盘内层纤维环+纤维环与髓核交界区细胞，细胞类型为类软骨细胞。 第二部分：针对大鼠腰椎间盘细胞Fas基因的siRNA有效序列筛选 目的：探讨化学合成的Fas-siRNA能否对体外培养的大鼠腰椎间盘细胞Fas基因进行有效沉默。 方法：利用化学合成的siRNA转染单层培养的椎间盘细胞。以优化转染方法转染，通过FAM荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)转染细胞检测转染率；另分六组：空白对照组不转染，无效序列siRNA转染组为阴性对照组，针对GAPDH的siRNA转染组为阳性对照组，三条Fas-siRNA转染组分别为Fas-siRNA1组、Fas-siRNA2组、Fas-siRNA3组。转染后在不同时间点分别观察细胞形态，检测细胞活性，检测mRNA及蛋白表达情况。 结果：以优化转染方法转染大鼠腰椎间盘细胞，转染率最高可达94.4％；化学合成的Fas-siRNA2能抑制体外培养的大鼠腰椎间盘细胞Fas基因、蛋白的表达，48小时达最低可分别达79.2％、71.3％。维持时间至少达72小时。 结论：化学合成的Fas-siRNA能对体外培养的大鼠腰椎间盘细胞Fas基因进行有效沉默。以优化转染方法转染大鼠腰椎间盘细胞可获很高的转染率和抑制效果。 第三部分：不同剂量FasL对转染和未转染椎间盘细胞凋亡的影响 目的：探讨重组大鼠FasL对在体外培养的转染和未转染Fas-siRNA2大鼠腰椎间盘细胞的凋亡作用和Fa的基因和蛋白表达。 方法：对单层培养的大鼠腰椎问盘内层纤维环+纤维环与髓核交界区细胞进行转染和不转染Fas-siRNA2，各设三组：三个转染组和三个未转染组各分别加入含不同浓度的FasL(0ng/ml、20ng/ml、50ng/ml)的1％FBS培养基共培养。24小时后，使用流式细胞术检测各组凋亡率，RT-PCR评估Fas基因表达，Western Blot检测蛋白表达。 结果：三个转染组和未转染组细胞凋亡率均随着FasL浓度的增加而增加；但相同浓度的20ng/ml、50ng/ml的FasL共培养下，转染组与未转染组细胞凋亡率有明显差异；同时，三个转染组Fas蛋白的表达低于未转染组，而Fas基因在各转染组间无差异。 结论：利用RNA干扰可部分降低Fas mRNA和蛋白的表达，利用RNA干扰的方法降低Fas的表达可减少FasL导致的椎间盘细胞的凋亡。