研究者们常常会运用花粉补充实验来检测植物花粉受限的程度,即在雌花上补充授粉,如果补充授粉的植株(花或者花序)产生了比自然植株(花或者花序)更多的果实或者种子,那么就界定其受到花粉限制。然而这一方法的合理性受到了研究者们的质疑。Knight等人在2006年综述中显示,263项实验设计中将近一半只在单花的水平上进行了花粉补充实验,然而这样的实验设计没有考虑到植株对资源的分配作用。与此同时,花粉补充实验中补充的花粉来自同种植物的其他植株,即实验中人为的补充了异花花粉,对自交亲和的植物而言,其交配系统大都是一定程度的自交和异交的混合,大量补充的异花花粉无疑是相较于自花花粉更优质的配子,雌性应当会放弃自花花粉而选择异花花粉,从而避免近交衰退、提高后代的数量和质量,也就是说传统的花粉补充实验有可能混淆花粉的质与量在花粉限制评估中的作用。本研究以野慈姑为材料探讨了实验处理水平(单花水平、花序水平)以及花粉质量(自花花粉、异花花粉)对花粉限制评估的影响。我们的实验假设单花水平的补充授粉实验会比花序水平的补充授粉实验高估植物的花粉限制程度,因为单花补充授粉会导致资源从其他未被补充授粉的雌花向被补充授粉的雌花流动;异花花粉会比自花花粉的补充授粉产生更多的果实,与此同时异花补充授粉的种子萌芽率会高于自花补充授粉的种子,也就是说异花花粉质量会高于自花花粉。实验结果显示实验处理水平会对花粉限制程度评估造成影响,我们的实验结果证明不同处理水平会会导致资源分配,但是单花水平花粉补充后得到的种子量明显比花序水平的少,这与我们的实验假说相反。这有可能是因为在单花补充实验的花序上出现了反方向的资源分配,即资源更多的流向了非补充授粉的花朵,这可能是由于我们的实验操作造成的:单花补充只是将整个花序的一朵雌花补充授粉并套袋,而此花序上的其他雌花并没有做任何处理,也就是说其他雌花处于自然状态,因为没被处理的雌花的授粉过程比补充授粉的雌花更均匀,故导致资源逆向分配。同时,补充授粉的花粉质量也会对花粉限制的评估造成影响,补充异花花粉比自花花粉产生了更多的种子,且萌芽率更高,这证明了我们的假说,即该体系的花粉限制不是数量的限制,而是优质花粉的限制。本研究首次在一个物种中证实了不同处理水平与花粉质量都会对花粉限制的评估造成影响。所以在后续的研究中,要特别注意在各方面允许的情况下,尽量对整个花序或者植株进行补充授粉的实验,这样才能有效的避免资源重新分配,更客观的评估花粉受限程度。同时,我们还建议此类的研究十分有必要加入自花补充和异花补充的对比实验,只有这样,我们才能正确认识花粉受限的原因,提出科学的对策。