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背景miRNA是一类内源性、序列高度保守、长约22个核苷酸的单链非编码小RNA,在转录后水平对靶基因表达进行调控。miRNAs参与了生物体诸多生理和病理过程。脂质代谢紊乱是动脉粥样硬化、肥胖、脂肪肝等代谢性疾病发生的病理基础,迫切需要阐明其发生机制,开发新的调节脂代谢的药物。虽然已有报道miRNA通过多种途径调控脂质代谢从而影响动脉粥样硬化的发展进程,然而miR-149-5p在脂质代谢中的作用机制研究仍未见报道。本研究中我们将初步探索miR-149-5p在脂质代谢中的作用及机制。目的探究miR-149-5p在脂质代谢中的生物学效应及其作用机制。方法1.高脂血症小鼠模型肝脏组织中miR-149-5p的定量检测。选取8周龄C57BL/6小鼠及LDLR-/-小鼠:C57BL/6小鼠分别使用普通饲养和高脂饲料饲养,LDLR-/-小鼠使用普通饲料饲养。15周后处死小鼠取肝脏组织提取miRNA,使用TaqMan?MicroRNA Assays定量检测miR-149-5p,并检测各小鼠血清总胆固醇和甘油三酯含量,分析miR-149-5p表达与血清总胆固醇含量的相关性。2.miR-149-5p靶基因预测。使用生物信息学方法,采用（Targetscan,DIANA,Pictar,miRWalk,miRDB,RNAhybrid,miRBase）在线服务进行miR-149-5p靶基因的预测。3.双荧光素酶报告基因载体质粒构建。使用pmir-GLO质粒构建各预测靶基因的luciferase质粒:引物设计,PCR扩增,凝胶电泳,PCR产物纯化,SacⅠ和XbaⅠ双酶切,切胶回收,与pmir-GLO载体连接,转化,涂板,挑单克隆,摇菌,质粒提取,测序。4.miR-149-5p Agomir转染剂量的选择。在HepG2细胞中分别转染不同浓度的miR-149-5p Agomir（激动剂）,使用TaqMan?MicroRNA Assays定量检测细胞内miR-149-5p,确定miR-149-5p Agomir最佳转染剂量。5.双荧光素酶报告分析。在HepG2细胞中转染构建的质粒及miR-149-5p Agomir,48 h后使用Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,验证miR-149-5p是否与靶基因3’UTR靶向结合,筛选miR-149-5p的靶基因。6.在HepG2细胞中验证靶基因及功能。在HepG2细胞中转染miR-149-5p Agomir或ANT（抑制剂）,48 h后收取细胞分别提取细胞总mRNA和蛋白,Real-Time PCR检测相关基因mRNA的表达,Werstern Blot检测相关蛋白的表达。7.在THP-1细胞中验证靶基因及功能。转染miR-149-5p ANT,48 h后收取细胞提取蛋白,Werstern Blot检测靶基因ABCA1蛋白的表达。在THP-1细胞中转染miR-149-5p ANT,6 h后换完全培养基,24 h后换不含血清的培养基过夜,第二日换加NBD-胆固醇的完全培养基培养4 h,然后加入ApoA1诱导胆固醇外流4 h,检测胆固醇外流。8.Ad-miR-149-5p及Ad-empty腺病毒的扩增、提取、纯化及滴度检测。在稀释为1.83×106个细胞/mL的293A细胞中加入腺病毒,培养扩增3-5天,Adeno-X?Adenoviral System试剂盒提取并纯化腺病毒。纯化后的腺病毒经梯度稀释后依次加入种好的293A细胞中。48 h后取出细胞板,细胞经固定,孵育一抗二抗后,DAB显色,镜下计数并计算病毒滴度。9.miRNA-149-5p在小鼠体内的影响。8周龄C57BL/6小鼠在高脂饲养15周后,使用尾静脉注射技术分别给实验组和对照组小鼠注射0.25mL含有0.9×109 IU Ad-miR-149-5p及Ad-empty腺病毒的PBS,10天后禁食12 h处死小鼠。收集血清及肝脏,Real-Time PCR检测肝脏相关mRNA,Werstern Blot检测肝脏相关蛋白,分别使用试剂盒检测血清ALT、AST、TG、TBA、HDL和LDL的水平,肝脏组织做免疫组织化学染色、HE染色和油红O染色。结果1.高脂血症小鼠模型中定量检测肝脏miR-149-5p发现:相较于普通饲料饲养的C57BL/6小鼠,高脂饲料饲养的C57BL/6小鼠（p<0.05）以及普通饲料饲养的LDLR-/-小鼠（p<0.01）肝脏组织中miR-149-5p明显升高;且高脂饲料饲养的C57BL/6小鼠（p<0.01）以及普通饲料饲养的LDLR-/-小鼠（p<0.01）血清中总胆固醇和甘油三酯明显升高。2.通过生物信息学分析发现miR-149-5p预测的靶基因与脂质代谢以及免疫炎症等有关,根据在线数据库分析所得miR-149-5p与预测靶基因的结合位点及自由能评分,我们成功构建了HMGCR、APOB、ABCA1、IGFBP5、MTHFR、FLT1、KCNIP1、PHLPP2、SP1、ESRP2、TNFα、NOS2、IFNαR1、IFNγ预测靶基因的luciferase质粒。3.HepG2细胞中转染miR-149-5p Agomir,转染剂量在0.02 nM-2 nM范围内随着转染剂量的增加,胞内miR-149-5p水平显著增加;当剂量达到10 nM后,miR-149-5p的水平不再显著增加而逐渐进入平台期。4.通过荧光素酶报告基因实验确定miR-149-5p可以与ABCA1、IFNαR1、IGFBP5以及PHLPP2预测靶基因的3’UTR结合,抑制靶基因的荧光素酶活性（ABCA1、IFNαR1、IGFBP5:p<0.01;PHLPP2:p<0.05）。5.HepG2细胞中miR-149-5p不影响靶基因ABCA1、IGFBP5、IFNαR1以及预测靶基因HMGCR的mRNA水平。在HepG2细胞中加入IFNα,miR-149-5p抑制IFNα的下游基因OAS1 mRNA及蛋白的表达（p<0.05）。THP-1细胞中,miR-149-5p的拮抗促进ABCA1蛋白的表达（p<0.05）以及胞内胆固醇外流（p<0.01）。6.在高脂饲养的C57BL/6小鼠模型中,尾静脉注射Ad-miR-149-5p腺病毒的小鼠:血清中LDL-C水平明显降低（0.74511±0.13791,p<0.01）,HDL-C及TG水平无改变;ALT水平明显降低（25.83387±7.40785,p<0.01）,AST水平无改变;总胆汁酸水平无改变;肝脏总mRNA的检测中CYP8b1的表达明显升高（p<0.01）,OSTα的表达明显降低（p<0.05）;肝脏蛋白检测中LDLR表达明显升高（p<0.05）,HMGCR蛋白表达无改变;肝脏组织切片,ABCA1的免疫组化染色无改变,HE染色及油红O染色显示抑制了肝细胞脂肪变性。结论miR-149-5p调控脂质代谢。1.HepG2细胞中,miR-149-5p可以抑制IFNα下游基因OAS1的表达。2.THP-1细胞中,抑制miR-149-5p可以促进巨噬细胞ABCA1蛋白的表达,并促进胞内胆固醇的外流。3.小鼠体内,miR-149-5p可以降低血清LDL-C水平,抑制肝脏脂肪变性。