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川乌是一种常用的传统中草药,有镇痉、回阳、逐冷、祛风湿的作用。由于其化学成分主要为剧毒的二萜双酯类生物碱、乌头碱,次乌头碱、中乌头碱等,所以临床应用较为慎重。目前,国内外已经从不同角度研究了乌头的生物学特性,化学成分,药理作用以及临床应用等情况,但是对于乌头的微生物转化方面的研究报道较少。本研究以实验室的菌种资源为依托,研究了微生物对川乌的转化发酵条件,同时对川乌转化产物的提取、分离、纯化条件进行了研究,为此类化学成分的生物转化研究提供了一定的理论依据。
采用川乌干粉为研究材料,利用实验室的菌种资源进行转化菌株的筛选,经过初筛和复筛,筛选出两株转化活性相对较好的菌株,编号分别为YM34492和YM31966。以形态特征为主要依据,同时参照ITS序列进行分析,鉴定菌株YM34492为杂色曲霉(Aspergillus versicolor),菌株YM31966为土生曲霉(Aspergillus terreu)。
通过四因素、三水平正交实验对菌株YM34492和菌株YM31966转化川乌干粉的固体发酵培养条件和培养基进行了优化,结果表明采用固体发酵方式,以中药材川乌为基质,7%接种量,28℃培养18天为最佳转化条件;培养基组成为川乌干粉∶鲜豆渣为3∶2,含水量为50%时,经高浓度乙醇沉淀提取,能够获得较高转化率的转化产物,且转化结果稳定。
按此发酵工艺,两转化菌株分别进行三批次扩大转化实验,采用氧化铝柱、硅胶柱和凝胶柱层析方法对转化产物的乙醇提取物进行成分分离,共获得6个化学成分,经13C NMR和1H NMR现代波谱分析,分别鉴定为:准格尔乌头碱,14-Dehydrodelphirine,雪上一枝蒿乙素,Crassicaulisine,腺嘌呤核苷,Ergosta-7,22-diene-2β,3α,9α-triol。确定其中14-Dehydrodelphirine为川乌化学成分被微生物转化后的产物。