缺氧由于细胞内氧浓度减少或氧利用度受限所致,它是一种普遍存在于机体的病理生理现象,包括心脏、肾脏和脑等重要器官的缺氧。其中心肌缺氧主要是心肌细胞正常新陈代谢所需要的氧供应不足,它可出现于多种心脏疾病,例如冠心病、心肌肥大、心肌梗塞、心力衰竭等。为了适应机体缺氧环境,哺乳动物细胞能够诱导缺氧相关基因,如血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)、各种糖酵解酶、葡萄糖转运体1、血红素氧合酶1(hemeoxygenase-1, HO-1),内皮素(endothelin-1, ET-1)等,而这些基因均受缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)调控。HIF-1是与细胞内氧浓度相关的转录因子,由HIF-1α和HIF-1β组成的异源二聚体。大量研究已经证明,其活性由α亚基决定。目前认为,HIF-1在100多种基因的转录、调控作用中起关键作用,这些基因广泛参与细胞功能的调控,包括血管生成、重建、收缩、葡萄糖和能量代谢、红细胞生成、铁稳态、pH调节、细胞增殖和生存等。而且HIF-1对急性、慢性、间歇性缺氧和缺血/再灌注等多种缺氧性损伤的保护作用也得到了证实。HIF-1α的活性受蛋白激酶磷酸化(protein kinase phosphorylation, PKP)的调控。其中,促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)及其下游细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3kinase, PI3K)其下游的Akt(又称蛋白激酶B; protein Kinase B, PKB)途径是两种重要的能使丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)磷酸化的蛋白激酶。大量研究证实,它们可通过调控HIF-1α的活性对缺血缺氧的心脏发挥保护作用。心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)是具有利钠利尿、调节血压和抵抗心肌肥大、纤维化、细胞增殖及心衰等心血管疾病的重要肽类激素。它主要由心房肌细胞合成和分泌。研究表明,缺氧是促进ANP分泌的重要因素之一。然而,HIF-1α参与调节缺氧诱导心房ANP分泌的作用尚存在争议。有研究报道,HIF-1并不是直接激活ANP分泌的因素；而另有研究主张,HIF-1可以直接或在缺氧早期阶段通过VEGF间接激活ANP基因的启动子,最终促进ANP的分泌。另外,MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导途径是否参与缺氧诱导心房ANP分泌的作用尚不清楚。因此,本研究利用离体家兔心房灌流模型,观察急性缺氧对心房ANP分泌的影响,探讨MAPK/ERK、PI3K/Akt信号转导途径及HIF-1α对急性缺氧诱导ANP分泌的作用,为进一步阐明缺氧诱导ANP分泌机制及其功能提供理论依据。本实验结果如下：1.在家兔离体搏动的心房灌流模型,急性缺氧明显促进心房ANP的分泌(P<0.001vs control),同时强烈抑制心房搏动压(P<0.001vs control)和心房搏出量(P<0.001vs control);2.急性缺氧明显增加HIF-1α的mRNA表达(P<0.01vs control),并提高其蛋白含量(P<0.001vs control);3. HIF-1α的两种抑制剂Rotenone (0.5μmol)和CAY10585(10μmol)明显下调缺氧诱导HEF-1α的mRNA表达(分别P<0.01,P<0.001vs hypoxia),并减少其蛋白含量(均P<0.01vs hypoxia);而且明显减缓缺氧促进ANP分泌的效应‘(P<0.001vs hypoxia);但心房搏动压和心房搏出量仍显著下降(均P<0.001vscontrol);4. MAPK/ERK的抑制剂PD98059(30μmol)和PI3K/Akt的抑制剂LY294002(30μmol)均可下调缺氧诱导HIF-1α的mRNA表达(分别P<0.01,P<0.001vshypoxia)及其蛋白含量(分别P<0.05,P<0.001vs hypoxia)。同时明显抑制缺氧诱导ANP的分泌(P<0.001vs hypoxia);而心房搏动压和心房搏出量仍明显下降(P<0.001vs control)。以上结果提示：1.急性缺氧通过HIF-1α明显增加离体家兔心房ANP的分泌；2. MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导通路通过调控HIF-1α基因表达的途径参与调节缺氧诱导ANP分泌的过程。心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)主要是由心房肌细胞合成和分泌的肽类激素。ANP作为心脏激素不仅具有利钠利尿、调节血压和电解质平衡活性,并且对心肌具有保护作用。大量研究早已证实,缺氧时ANP分泌明显增加可促使细胞适应缺氧环境。然而,缺氧促进心房ANP分泌的作用机制至今尚不甚清楚。蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)是一种催化蛋白磷酸化酶,是细胞内激活多种底物蛋白酪氨酸残基磷酸化的关键酶。迄今,人类基因组中发现大约有90种受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs)和43种RTKs相关基因,它们激活一些生长因子或细胞因子并将其信号从细胞外转导进入细胞内,进一步调节细胞生长、增殖、分化、新陈代谢、迁移和凋亡等功能,是维持正常细胞稳态的关键角色。根据PTKs是否存在膜受体,可将其分成两种类型：RTKs也称功能型受体和非受体型酪氨酸激酶(non-receptor tyrosine kinases, NRTKs)即游离型激酶。大量研究发现,PTKs的突变或者异常细胞内信号的激活是导致多种疾病的关键因素,而且它也是参与调节缺氧的重要信号转导途径。目前关于PTKs对糖尿病、肿瘤等疾病的炎症、恶性细胞转化和新生血管生成等方面的研究较多见,但心血管系统等其他领域的疾病研究则较少。近期报导显示,缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor1α, HIF-1α)调节基因,包括血小板源生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、胰岛素样受体(insulin-like growth factor, IGF-1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等活性与PTKs信号转导途径有密切关系。由于促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular Signal regulated kinase, ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide3kinase, PI3K)/Akt是PTKs信号转导通路的重要下游信号途径。最新研究证实,MAPK/ERK和PI3K/Akt信号转导途径通过调控HIF-1α的活性而参与调节缺氧诱导ANP分泌。另有研究表明,PTKs在调节HIF-1α活性中至关重要。然而,PTKs是否参与调控缺氧诱导心房ANP的分泌尚不清楚。另外,环氧酶(cyclooxygenase, COX)是合成前列腺素(prostaglandin, PGs)的必须酶。几乎所有哺乳动物的心肌细胞中,COX都能催化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)转变成PGs。PGs具有强大的自分泌和旁分泌功能。相关实验证实,PTKs信号途径参与PGs的合成,其中COX的表达,尤其是COX-2与PTKs信号途径有密切关系。然而分析PGs与ANP分泌关系的研究发现,即使PGs调控ANP分泌的作用机制仍存在某些分歧,但多数普遍认为PGs是调节A.NP分泌的重要物质。体内、体外实验中显示,COX抑制剂能够抑制PGs的合成、减少ANP的分泌；COX还可以通过ET-1影响ANP的分泌。但是,PTKs-COX途径与缺氧诱导ANP分泌的关系并不十分清楚。‘因此,本研究利用离体大鼠心房灌流模型,观察急性缺氧对大鼠心房ANP分泌的影响,探讨PTKs及其下游信号转导途径对急性缺氧诱导ANP分泌的作用及其机制,为进一步阐明缺氧诱导ANP分泌机制及其功能以及临床诊治相关疾病提供重要的理论和实验依据。本实验结果如下：1.在大鼠离体搏动的心房灌流模型,急性缺氧明显促进心房ANP的分泌(P<0.001vs control),同时强烈抑制心房搏动压(P<0.001vs control);2. PTKs的抑制剂genistein(3μmol)明显减缓缺氧诱导ANP分泌的效应(P<0.001vs hypoxia alone)且未改变缺氧显著抑制心房搏动压作用(P>0.05vs hypoxia alone);3.缺氧明显增加心房肌组织p-ERK及p-Akt蛋白质表达增强(P<0.001vs control),而genistein明显抑制缺氧增加p-ERK表达的作用(P<0.01vs hypoxia alone);且基本阻断缺氧提高的pAkt活性的效果hypoxia alone);4.MAPK/ERK及PI3K/Akt阻断剂PD98059(30pμol/L). LY294002(30μmol/L)联合genistein可进一步增强genistein抑制缺氧诱导心房ANP分泌的效果(均P<0.001vs genistein+hypoxia),但PD98059+genistein或LY294002+genistein均不能改变缺氧抑制心房搏动压的效应(均P<0.001vs control);5. Rotenone(0.5μmol)或CAY10585(10μmol)两种HIF-1α的抑制剂结合genistein进一步增强genistein减缓缺氧诱导心房ANP分泌的效果(均P<0.001vsgenistein+hypoxia),但心房搏动压仍明显受到抑制(均P<0.001vs control);6.缺氧明显增加心房肌组织HIF-1α及GATA4基因表达(P<0.001vs control), genistein、rotenone+genistein、CAY10585+genistein、PD98059+genistein及LY294002+genistein均能不同程度的抑制缺氧诱导的HIF-1α及GATA4的活性(均P<0.05vs hypoxia alone);7.COX阻断剂indomethacin (10μmol/L)可明显减缓缺氧促进心房ANP分泌的作用(P<0.001vs hypoxia alone),但并不改变缺氧时心房搏动压受到抑制的效应(P<0.001vs control);8. Genistein、PD98059或LY294002均能进一步增强indomethacin对缺氧诱导心房ANP分泌的抑制效果(均P<0.001vs hypoxia alone),但仍不能改变缺氧抑制心房搏动压的作用(P<0.001vs control);9.缺氧明显增加COX-2的表达(P<0.001vs control),而indometEacin、genistein或二者联用均可明显抑制缺氧增加COX-2表达的效应(均P<0.05vs control, P<0.001vs hypoxia alone)。以上结果提示：1. HIF-1α通过GATA4调节急性缺氧诱导大鼠心房ANP的分泌；2. PTKs-MAPK/ERK或-PI3K/Akt信号转导通路通过调控HIF-1α的活性调节急性缺氧诱导心房ANP的分泌；3.COX参与PTKs调控急性缺氧诱导心房ANP分泌的过程。