小鹅瘟细胞适应毒的培育及其特性的研究

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小鹅瘟(Gosling Plague, GP)是危害养鹅业健康发展的最严重的传染病之一。目前主要采用免疫产蛋母鹅,使小鹅获得母源抗体的方法进行该病的预防,但是小鹅瘟疫情还是时有发生。本研究通过鹅胚分离小鹅瘟病毒,将含病毒的尿囊液进行SDS-PAGE试验筛选出蛋白条带最佳的病毒,然后在鹅胚成纤维细胞(GEF)上连续传代培养,使之适应GEF并致弱,已获得可以在小鹅使用的小鹅瘟细胞弱毒疫苗。采集疑似小鹅瘟的病死鹅组织,通过鹅胚分离培养,取能致死鹅胚但不能凝集鸡红细胞的鹅胚尿囊液,用抗GPV的特异性单克隆抗体进行Western-blot检测,结果共得到8株GPV。将分离获得8株病毒与实验室保存的6株病毒的尿囊液分别用氯仿处理两次,经PEG6000浓缩十倍,在相同蛋白含量的情况下进行SDS-PAGE。比较各个分离毒的蛋白条带差异,结果发现AHTC20100225株VP3含量最高,提示其是抗原性较好病毒,可以进行细胞培育筛选。将GPV AHTC20100225株和GPV-SYG61株,分别在鹅胚成纤维细胞(GEF)上连续盲传培养,用抗GPV的特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光(IFA)检测发现AHTC20100225株从第14代、GPV-SYG61株从第10代开始出现特异性荧光,将这两株细胞适应毒继续在GEF上分别培养到第40代和第70代。每隔五代测一次这两株细胞适应毒的半数组织感染量(TCID50),结果发现它们的TCID50都能稳定在10-5/0.2ml左右。用IFA方法确定SYG61株第70代细胞适应毒(SYG61-g70)感染GEF后的最早检出时间为第12h。将SYG61-g70接种易感鹅胚,测得其鹅胚半数致死量(ELD50)为10-1.5/0.2ml,远高于SYG61-gO的(ELD50为10-60/0.2ml),表明其对鹅胚的致死力降低了3.16×104倍。将SYG61-g70稀释后免疫1日龄易感雏鹅,并与正常对照雏鹅混养,结果发现对照雏鹅均正常,103个TCID50的SYG61-g70不能引起雏鹅死亡。用稀释后的SYG61-g70免疫1日龄雏鹅,然后每隔5天采血,分离血清,用血清中和试验的方法检测鹅体内抗体变化情况,结果显示抗体水平在前15天逐渐升高,效价最高可达10-2.84/0.2ml,15天左右缓慢下降,始终维持10-2/0.2ml左右。用稀释后的SYG61-g70免疫1日龄易感雏鹅,5天后注射102.1个LD50的GPV强毒JTG20100319,雏鹅全都没有死亡,而攻毒对照组的死亡率为80%,结果表明625个TCID50的SYG61-g70能保护住至少100个LD50的JTG20100319的感染。综上所述,SYG61株有望成为优良的GPV细胞弱毒疫苗株。
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