氨气致肉鸡淋巴器官炎症、自噬和凋亡的机理研究

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氨气(NH3)是一种无色、水溶性、刺激性的碱性气体,由含氮物质还原和有机物的细菌分解产生。NH3是鸡舍中的主要环境污染物之一,对人体和鸡的健康构成威胁。此外,NH3在大气污染重发挥重要的作用,是大气气溶胶的组成成分,对人类和其他生物带来负面影响。鸟类对NH3高度敏感。空气中的NH3能抑制肉鸡的免疫力,甚至增加肉鸡的死亡率。鸡淋巴器官(法氏囊和胸腺)在免疫中具有重要作用。然而,NH3对鸡淋巴器官(法氏囊和胸腺)的害作用的生物学机理仍然不清楚,因此,本研究旨在从多角度(炎症、凋亡和自噬)探讨NH3对鸡淋巴器官(法氏囊和胸腺)的毒性作用的机理。将135只实验(Ross 308)鸡随机分为三组,每组NH3浓度分别为:低NH3组(对照组)为5.0 mg/m3 NH3,中NH3组为 10.0-15.0 mg/m3 NH3,高 NH3组为 20.0-45.0 mg/m3 NH3。在实验的第 14 天、第 28 天和第42天,将鸡安乐死(每次每组45只),采集法氏囊和胸腺样品。为了研究NH3对鸡法氏囊和胸腺组织的毒性影响,我们进行了苏木精和伊红染色,透射电镜,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL),免疫荧光(IF),酶联免疫吸附试验(ELISA),微孔板分光光度法,qRT-PCR,蛋白免疫印迹检测。开展了如下研究内容:炎症、细胞凋亡以及自噬的形态学变化,NO含量、iNOS活性、炎性相关因子含量(包括白细胞介素6(IL-6)和IL-1β、以及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、炎症相关因子(包括核因子kappa B(NF-κB)、环氧合酶-2(Cox-2)、toll样受体2A(TLR-2A)、iNOS,IL-6、IL-10、IL-18和IL-1β)的mRNA表达、氧化应激相关指标(包括过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、胃液γ-谷氨酰转移酶(GGT)和总抗氧化能力(T-AOC))的含量和活力、细胞凋亡相关因子(包括p53、细胞色素C(Cyt-C)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2 X蛋白(Bax)、Bcl-2 同源拮抗剂杀伤蛋白(Bak)、caspase-3、caspase-9、cleaved casapase-3 以及cleaved caspase-9)的mRNA和蛋白表达、线粒体相关因子(包括动态蛋白相关蛋白1(Drp-1)、有丝分裂融合1/2(Mfn1/2)、线粒体裂变因子(Mff)、光萎缩1(Opal))的mRNA和蛋白表达、三磷酸腺苷(ATPase)相关因子(包括Na+/K+ ATPase、Ca2‘ATPase、Mg2+ATPase以及Ca/Mg2+ATPase)的活力、自噬相关因子(microRNA-99a-3p、雷帕霉素靶标(mTOR)、微管相关蛋白轻链轻链3-I(LC3-I)、LC3-Ⅱ、磷酸盐和张力蛋白同源物(PTEN)、蛋白激酶B(AKT)、自噬相关-5(ATG-5)、Becline-1和动力蛋白(Dynein))的mRNA和蛋白表达、能量相关因子(乌头酸酶2(ACO-2)、己糖激酶1(HK-1),己糖激酶2(HK-2),乳酸脱氢酶A(LDHA),乳酸脱氢酶B(LDHB),丙酮酸激酶(PK),磷酸果糖激酶(PFK)和琥珀酸脱氢酶复合物-B(SDB)的活力)的mRNA和蛋白表达、血清生化参数(碱性磷酸酶(AKP),天冬氨酸转氨酶(AST),丙氨酸转氨酶(ALT)和γ-谷氨酰转移酶(GGT)活力。结果表明:(1)NH3损伤了法氏囊和胸腺组织,包括导致炎症、凋亡和自噬。(2)NH3 暴露提高了 H2O2、GGT 和 MDA 抗氧化酶,降低了 CAT、GSH、GSH-Px、SOD和T-AOC,引起了鸡淋巴器官氧化应激。(3)在NH3暴露下,NO含量和iNOS活性以及炎症相关因子(NF-κB、TLR-2A、Cox-2、iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-18 和 IL-10 的 mRNA表达升高了,炎症反应发生了。(4)NH3暴露降低Bcl-2、mnf1、mnf2和opA1的mRNA和蛋白表达,提高了 Bax、Bak、caspase-3、caspase-9、p-53、Cyt-C、Drp-1 和 mff 的 mRNA 表达,降低了 caspase-3和caspase-9蛋白的表达水NH3暴露平,引起了鸡淋巴器官细胞凋亡。。(5)NH3 暴露抑制了自噬相关基因 mTOR、LC3-I、LC3-II、PTEN、AKT、atpg-5、Becline-1和Dynein的mRNA和蛋白质表达,增加了 microRNA-99a-3表达,损伤了CD8+B 和 T 淋巴细胞,降低了 ATP 酶(Na+/K+ATPase,Ca2+ATPase,Mg2+ATPase)活力,并抑制能量代谢相关基因(ACO-2、HK-1、HK-2、LDHA、LDHB、PK、PFK和SDHB)的mRNA和蛋白质表达。导致了鸡淋巴器官自噬。microRNA-99a-3通过负调控靶基因PTEN参与了 NH3引起鸡法氏囊自噬。(6)NH3暴露增加了血清生化指标ALT,AKP,AST活性,意味着鸡受到NH3的负面影响。总之,我们的发现表明,NH3暴露会影响肉鸡淋巴器官的结构完整性和正常功能,线粒体功能障碍和氧化应激,干扰能量代谢和ATPase活性的过程,并通过炎症,凋亡减少CB8+B和T淋巴细胞并且,自噬。综上所述,我们的发现为评估接触NH3对肉鸡的有害影响以及人类病理生理学提供了线索。
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