目的:清金得生片（药物组成:麦冬、红参须、关黄柏、法半夏、紫河车、绞股蓝等）乃国医大师周岱翰教授针对肺癌“虚、痰、瘀、毒”病机所创,具有益气除痰、清肺解毒、扶正消瘤的功效。本文通过回顾临床清金得生片的使用,观察清金得生片治疗Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者的临床疗效;通过基础实验研究清金得生片的抑瘤作用及其可能的机制,为清金得生片的应用提供更多临床循证依据及研究基础。方法:第一部分:收集2017年1月1日-2020年6月30日在广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心治疗的Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者,依据治疗期间（化疗、靶向药物治疗及免疫治疗）是否配合口服清金得生片分为治疗组（88例）及对照组（98例）,并收集患者的临床资料及总生存期（Overall survival,OS）。采用卡方检验比较治疗组及对照组患者的临床资料（包括性别、年龄、吸烟史、TNM分期、病理类型、病理分化程度、KPS评分、基因突变情况、TKI及免疫治疗情况、化疗线数和入组时治疗线数）的基线情况;采用Kaplan-Meier法分析两组患者的OS,采用Log-rank test对生存曲线进行比较;采用单因素与多因素COX回归模型分析两组临床资料与OS之间的关系。第二部分:（1）按标准方法制备清金得生片（Qingjin Desheng Pian,QJDSP）冻干粉,作用于A549细胞,MTT实验检测QJDSP对A549细胞活力影响,计算QJDSP的半数抑制率（half-inhibitory concentration,IC50）;细胞克隆实验检测QJDSP对A549细胞增殖的影响;细胞划痕试验、Transwell实验检测QJDSP对A549细胞迁移的影响;通过流式细胞术检测细胞周期,研究QJDSP对A549细胞周期的影响。（2）构建A549皮下荷瘤小鼠模型,给予QJDSP灌胃处理,给药方案为:模型组予纯水灌胃;顺铂组予顺铂2mg/kg腹腔注射;QJDSP低剂量组（546mg/kg）、QJDSP中剂量组（1092mg/kg）及QJDSP高剂量组（2184mg/kg）分别予对应浓度的QJDSP药液灌胃处理。给药期间定期测量小鼠移植瘤体积。给药结束后处死小鼠,剥离移植瘤,观察各组裸鼠瘤体体积并称重,研究QJDSP对A549皮下移植瘤生长的作用。第三部分:（1）我们通过对高剂量组及模型组小鼠瘤体进行高通量测序,筛选潜在的作用信号通路。通过对比两组瘤体m RNA的表达变化情况,筛选出表达显著差异的基因;通过比对Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库,对差异基因进行细胞功能富集和信号通路富集分析。（2）基于测序结果,采用小干扰RNA（si PIK3R1）转染A549细胞,利用细胞克隆实验研究PI3K对A549细胞平板克隆形成能力的影响;采用细胞周期实验检测PI3K对A549细胞周期的影响。（3）使用清金得生片及PI3K特异性抑制剂LY294002干预A549细胞,实验分组为:control组、QJDSP组、LY294002组（以下简称“LY组”）及LY294002+QJDSP（以下简称“LY+QJ组”）。利用细胞克隆实验研究QJDSP、LY294002分别使用及联用时对A549细胞平板克隆形成能力的影响;采用细胞周期实验检测QJDSP、LY294002分别使用及联用时对A549细胞周期的影响。（3）Western blot及q PCR进一步研究si PI3K、QJDSP、LY294002分别使用及联用时对PI3K/AKT信号通路及CDK2、cyclin A2的蛋白和m RNA水平的影响。（4）Western blot及q PCR进一步验证QJDSP对A549皮下移植瘤的PI3K/AKT信号通路及CDK2、cyclin A2的蛋白和m RNA水平的影响。结果:第一部分:（1）两组病人的基线情况比较均无统计学意义。随访过程中,对照组有3例患者删失,73例死亡患者,12例患者仍生存;治疗组有4例患者删失,62例死亡患者,32例患者仍生存。对照组的中位生存时间是21个月,治疗组的患者中位生存时间是25个月,对照组的患者其OS明显低于治疗组（<0.05）。（2）同时,在进行COX回归分析的时候,我们发现治疗期间是否配合清金得生片及是否行免疫治疗与患者的生存期具有相关性,即清金得生片配合化疗、靶向药物及免疫治疗相对于无清金得生片配合的患者可以降低35.3%的死亡风险;进行免疫治疗相对无免疫治疗患者可以减少54.8%的死亡风险。第二部分:（1）细胞实验中,QJDSP具有抑制A549细胞活性、增殖、成克隆能力、迁移的作用,且该抑制作用具有时间和剂量依赖性。A549细胞经过不同剂量（0.1mg/ml-0.9mg/ml）梯度的QJDSP干预24h、48h及72h后:同样的时间内,与control组比较,随着QJDSP浓度的升高,细胞存活力降低;同样的浓度下,随着QJDSP处理时间的延长,A549细胞存活力呈下降趋势。QJDSP抑制A549细胞生长,呈时间依赖性和剂量依赖性,同一时间点各浓度QJDSP之间A549细胞存活力有显著性差异（<0.01）,同一浓度QJDSP在各时间点A549细胞存活力亦有统计学差异（<0.01）。细胞克隆实验结果显示随着QJDSP浓度的升高,对细胞增殖的抑制能力增强（<0.01）。A549细胞铺满6孔板后用枪头进行划痕,24h后观察control、QJDSP-1×和QJDSP-2×组愈合率,control组愈合率明显高于QJDSP-1×和QJDSP-2×组（<0.01）;Transwell实验发现A549细胞经QJDSP处理后,穿越小室的细胞数量明显降低（<0.01）。流式细胞术检测细胞周期实验表明,与control组相比,QJDSP可明显将A549细胞阻滞在S期。（2）动物实验中,QJDSP可有效抑制荷瘤裸鼠皮下移植瘤的生长速度、瘤体的大小及重量。给药第6天后,与模型组相比较,QJDSP高剂量组移植瘤体积增速减缓,两组比较有显著性差异（<0.05）,说明QJDSP高剂量组可抑制裸鼠移植瘤体积的增长,该抑制作用随给药时间的延长而增强。QJDSP高剂量组与模型组比较,瘤体重量下降（<0.01）,QJDSP有抑制肿瘤重量的作用。第三部分:（1）荷瘤裸鼠肿瘤组织样本转录组测序得到有效的差异表达基因355个,其中上调基因93个,下调基因262个。通过比对GO分析发现,生物过程（Biological Process,BP）主要富集在DNA复制、有丝分裂细胞周期的G1/S转换、细胞增殖的正调控、蛋白磷酸化和磷酸化负调控等;细胞组分（Cell Component,CC）主要在胞浆、染色质、核质、免疫突触和细胞质核周区等富集;分子功能（Molecular Function,MF）主要富集在蛋白质结合、转运活性、蛋白激酶活性、激酶活性和蛋白酶结合等。KEGG通路富集分析发现,这些差异表达基因与细胞周期、细胞凋亡、PI3K/AKT信号通路、Fox O信号通路、HIF-1信号通路、Ras信号通路、Rap1信号通路、TNFα信号通路、MAPK信号通路等有关。（2）细胞克隆实验结果表明敲低PI3K的表达,使用QJDSP、LY294002及LY294002联合QJDSP干预A549细胞,对细胞具有抑制增殖的作用。细胞周期实验表明,与control组相比,敲低PI3K的表达、使用QJDSP、LY294002及LY294002联合QJDSP干预可明显将A549细胞阻滞于S期。（3）为进一步研究机制,我们采用了Western blot和q PCR检测发现敲减PI3K表达、使用QJDSP、LY294002及LY294002联合QJDSP干预会抑制PI3K/AKT通路活性及CDK2、cyclin A2的表达。（4）对荷瘤小鼠的A549皮下移植瘤进行了Western blot和q PCR检测,发现QJDSP亦可以抑制PI3K/AKT通路活性及CDK2、cyclin A2的表达,与细胞实验结果互相印证。结论:1.治疗期间配合口服清金得生片可能是Ⅲ-Ⅳ期非小细胞肺癌患者OS的独立预后因子,可以帮助延长肺癌患者的总生存时间。2.清金得生片以时间和剂量依赖性的方式抑制A549细胞活性、增殖和迁移,阻滞A549细胞于S期;并抑制裸鼠A549皮下移植瘤的体积和重量。3.清金得生片可能通过抑制PI3K/AKT通路活性从而抑制CDK2和cyclin A2蛋白和m RNA的水平,诱导A549细胞发生S期停滞,达到抑制细胞增殖及抑瘤的作用。