论文部分内容阅读
背景:
国际上,因脑复苏临床试验Ⅰ和Ⅱ(硫喷妥钠负荷和钙通道阻滞药)未取得突破性进展,从分子到整体水平研究再灌注后脑细胞死亡机理成为目前基础研究的重点。
在国内,早在60年代就开始应用头部低温,并发展为头部重点低温综合疗法。在我院已经成功救治心跳停止5min以上患者30余例,该疗法已在国内广泛推广应用。越来越多临床病例证实该疗法为有效的脑复苏方法,但对其作用机制尚未完全阐明。
目的:本研究利用“四血管”式兔脑缺血模型,从定量形态学的角度观察了兔脑完全性缺血30min后不同再灌流时段大脑12个区域的神经元损伤程度,和检测了脑组织内14项再灌注损伤相关生化因子的变化;并比较了再灌流时是否实施头部重点低温对神经元损伤程度和后者与脑组织中这此生化参数的水平之间相关系数的影响,旨在证明头部重点低温能否减轻神经元所遭受的缺血-再灌流损伤和可能的途径,并进一步探讨相应的生化机理等。
方法:1.动物准备:健康新西兰白兔,体重1.8~2.2kg,实验前禁食12小时,自由饮水。全部手术操作均严格无菌。采用1%异戊巴比妥钠6ml/kg、芬太尼10μg/kg给动物实施麻醉。气管切开后实施机械通气,要求PaO2100>mmHg和PaCO230-50mmHg。测得正常兔脑温度为38±0.5℃,肛温为37±0.5℃。
2.完全性脑缺血方法是同时夹闭双侧内乳动脉,无名动脉和左锁骨下动脉的止血带,配合动脉放血将MAP下调至50~70mmHg。缺血时间为30分钟。开放止血带为再灌流开始,此期间要求MAP维持在80~120mmHg。
3.头部重点低温的实施再灌流开始时实施,采用头部冰帽为主的体表降温方法,辅以静注冬眼合剂(氯丙嗪和哌替啶0.5mg/kg)。要求30分钟内降至脑温为28±0.5℃,肛温为34±0.5℃。
4.分组将兔随机分为3组,Ⅰ组为未缺血组[n=24,(38±0.5)℃];Ⅱ组为常温再灌流组[n=72,(38±0.5)℃];Ⅲ组为头部重点低温治疗组[n=72,(28±0.5)℃,开始再灌流时实施头部重点低温],后两组动物的3个亚组(n=24)在脑完全性缺血30分钟后分别再灌流30、180和360分钟。
5.形态学分析:采用福尔马林磷酸缓冲液在体固定脑组织,10μm的切片常规染色后,用计算机对神经细胞图像进行分割处理、分类计数。依据细胞核的形态参数等将神经元区分为四类:A(正常),B(轻伤),C(重伤)和D(坏死)。共观察了大脑额叶、项叶、颞叶、枕叶的皮质,纹状体,丘脑,海马,中脑,脑桥,延脑,小脑的浦肯野细胞和颗粒细胞等12个部位。
6.生化参数检测动物按预定时间处死后,0℃环境下迅速分离出脑组织50mg,制备出脑细胞膜粗样(BCM)和去膜组织匀浆(PMS),按先前报道的方法测定以下生化参数:BCM上Na+,K+-ATPase、Ca2,Mg2+-ATPase和磷酯酶A2(PLA2)活力,膜磷脂(Pi);PMS中葡萄糖(G)含量,谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸(ASP),CPK活力;脑组织水含量;下丘脑中β-内腓肽(β-EP),血管活性肠肽(VIP),血管紧张素(AVP);脑静脉血中T3、TSH和TXB2、PGI2。
7.统计学方法所有数据全部进入专用数据库,采用统计包(SPSS9.0)做统计分析。计量资料统计描述用均数±标准差表示(X±SD),均数比较采用未配对资料t检验,或多组间均数采用x2检验;相关分析(神经元数量与生化参数水平)采用两两相关法(Bivariatecorrelation)。等级资料个等级所占比例用百分数表示(四类神经元数量),组间比较用秩和检验。检验标准:P<0.05,有显著的统计学意义;
结果:1.与Ⅰ组相比,Ⅱ组A类神经元所占百分比在再灌注时逐步下降,D类则进行性增多(均P<0.01);与Ⅱ组对应亚组相比,Ⅲ组A类进行性增多,D类显著减少(均P<0.01)。
2.与未缺血动物相比,脑静脉血中游离T3和TSH、CPK活力、去细胞膜匀浆中Glu、BCM上的PLA2在再灌流30、180和360rmin时,Asp和脑含水量在再灌流30和180rmin显著高于未缺血水平,相差有显著的统计学意义(均P<0.01)。Na+,K+-ATP酶活力、VIP和β-EP在再灌流30、180和360min时,Ca2+,Mg2+-ATP酶活力、AVP、葡萄糖和细胞膜总磷脂在在再灌流180和360min时显著低于未缺血水平,相差有显著的统计学意义(均P<0.01)。
与Ⅱ组对应亚组相比,经SHC治疗后脑静脉血中游离T3和TSH、CPK活力、BCM上的PLA2在再灌流30、180和360min时,脑含水量在再灌流30和180min时,Glu在再灌流360min时,Asp在再灌流180min时升高趋势消失,相差有显著的统计学意义(均P<0.01)。Na+,K+-ATP酶活力、VIP和β-EP在再灌流30、180和360min时,Ca2+,Mg2+-ATP酶活力、葡萄糖和细胞膜总磷脂在再灌流180和360min时AVP在再灌流30和360min时的下降受到明显控制,相差有显著的统计学意义(均P<0.01)。
3.Ⅱ组与A类改变相关的生化指标是VIP、β-EP、PGI2、T3和Na+,K+-ATPase;与B类是β-EP和TXB2;与C类是G、TXB2/PGI2,AVP;与D类是T3、Na+,K+-ATPase、Glu和VIP(P<0.05)。Ⅲ组Ca2,Mg2+-ATPase与A、C和D类变化相关(P<0.05)。
结论:在本“血管式”免脑缺血模型上,缺血30后再灌流时实施的6小时头部重点低温仍能有效地减轻兔脑神经元所遭受的缺血再灌流损害,形态学观察结果提示:该疗法的作用途径在于:(1)大力减少重伤和坏死神经元的增多,主要是通过遏制损伤神经元进一步向→重伤→坏死的发展;(2)复苏轻伤神经元,促进受损神经元从轻伤→正常的良好转归;和阻止轻伤神经元转变为重伤神经元;(3)保护和保存再灌流时正常或接近正常状态神经免遭进一步的损伤。但我们的结果同时也显示出该疗法的有限性,主要是对重伤神经元仅有很微弱的复苏作用,不能完全中止坏死神经元的增加,和对已经坏死的神经元并无回天之术。
综合分析与脑损伤相关的14项生化参数改变,证实头部重点低温有效的生化机理至少有以下5个方面:(1)具有优良的膜稳定作用,并促进膜功能的恢复,阻止胞浆酶的泄漏。主要表现在促进Na+,K+-ATPase和Ca2+,Mg2+-ATPase活力的恢复来稳定细胞膜功能,抑制的PLA2活力的升高来阻止细胞膜磷脂的破坏。(2)遏制再灌流早期的高代谢状态,恢复低水平的能量供需平衡;(2)大幅度减少兴奋性氨基酸的过度释放;主要是缩短Glu的释放高峰,从而缓解兴奋性神经毒性。(4)纠正神经肽的内分泌紊乱和维持TXB2/PGI2的消长平衡。(5)多途径阻断脑水肿的发生和发展,为细胞的修复提供一个宽松的环境。
从神经元损伤程度与生化参数间相关分析的结果提示:在头部重点低温减轻神经元所遭受的缺血再灌流损伤中占主导地位的是:稳定细胞膜和阻断高代谢状态,而纠正神经内分泌紊乱和维持TXB2/PGI2的消长平衡也起了一定的作用。