目的：糖尿病肾病(diabeticsnephropathy，DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)严重的并发症。DN进展至终末期出现的肾衰竭是DM患者的主要死亡原因之一。糖尿病肾病的基本病理改变为细胞外基质(extra-cellularmatrix，ECM)重构，即ECM量和组成成分的明显变化，最终导致肾小球硬化和肾小管间质纤维化。DN发病机制错综复杂，目前尚未完全明了。糖尿病状态下，肾脏血流动力学紊乱、蛋白质非酶糖化增高、多元醇通路激活、细胞增殖和凋亡等因素不仅参与了DN的发生、发展，而且这些因素还引致肾脏细胞信号转导通路发生改变，进一步加重肾脏细胞的损害。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedProteinKinase，MAPK)途径在高血糖状态下被激活，参与DN的发生、发展，是近年来倍受关注的一条细胞内重要的信号转导途径。近来研究表明，P38丝裂原活化蛋白激活(P38mitogen-actvatedproteinkinase，P38MAPK)是MAPK家族的一员，它的信号转导通路在高糖状态下激活，使各种核转录因子活化，影响目的基因的表达。转化生长因子TGF-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)作为致纤维化因子在DN中起重要作用，可以促进ECM的积聚和肾脏纤维化。P38MAPK与TGF-β1存在明显的相互作用，一方面，TGF-β1通过增强P38MAPK的活性而发挥其生物作用，另一方面，P38MAPK通过影响TGF-β1的生成而影响DN的进程。以往在DN的研究中，肾小球病变得到了广泛关注，而对肾小管间质病变的研究却极为有限。DN早期病理特征之一是肾脏肥大，除肾小球肥大外，还表现为肾小管上皮细胞肥大及肾小管基底膜的增厚，而早期发生这些结构改变被认为是启动和促进肾小管间质组织纤维化进程的关键因素；且该致病作用可能并不完全依赖于肾小球病变。另据报道，DM出现肾小球病变之前即可存在小管间质病变，尤其是肾小管近端部分，由于其在肾脏中的特定位置和重吸收功能，使其易于受到直接或间接的病理损害。进一步研究证实，糖尿病状态下，肾小管病变的严重程度，和尿蛋白排泄量、肾功能密切相关，并直接影响其预后。因此，关注DN肾小管间质病变具有非常重要的意义。 近年来，AngⅡⅠ型受体拮抗药(AT1Ra)，对糖尿病肾病的保护作用，即改善糖尿病肾病血流动力学紊乱，不依赖血压变化的影响，而是影响细胞因子的生成和细胞增殖或肥大及基质蛋白的积聚，缓解肾小球硬化，降低蛋白尿，这些得到了广大肾病学者的认可，但AngⅡⅠ型受体拮抗药——氯沙坦对DN肾小管间质的保护作用国内未见报道。本实验应用糖尿病大鼠模型，应用氯沙坦灌胃，通过观察肾小管间质病理改变，免疫组织化学方法检测P38MAPK、TGF-β1、Ⅳ型胶原和α-SMA蛋白及RT-PCR检测P38MAPKmRNA、TGF-β1mRNA的表达情况，以阐明P38MAPK和TGF-β1在糖尿病大鼠肾小管间质损伤中的作用以及氯沙坦对肾小管间质的保护作用。 方法：选择健康雄性Wistar大鼠36只，体重150～180g，随机抽取24只大鼠腹腔注射链脲佐菌素(65mg/kg)溶于柠檬酸缓冲液(0.1mol/L，浓度为1％，PH为4.5)，制备糖尿病大鼠模型，48h后尾动脉采血测血糖，试纸法测尿糖，空腹血糖≥16.7mmo1/L，尿糖+++～++++确定为糖尿病大鼠模型。剩余12只大鼠为正常对照组(A组)，只注射相当体积的柠檬酸缓冲液。于造模成功后第二周，将糖尿病大鼠24只随机分为糖尿病对照组(B组，12只)和氯沙坦干预组(C组，12只)，C组给予氯沙坦40mgkg-1d-1灌胃，每日一次，A组和B组仅给予等量自来水灌胃。实验期间，大鼠自由饮水，标准饮食，不使用胰岛素和其它降糖药。分别于实验开始的第6周、10周每组任取6只大鼠处死，大鼠处死前分别测体重，代谢笼收集尿液、尿量，并检测尿蛋白、尿肌酐；留取血标本，检测空腹血糖、血肌酐、尿素氮。迅速切取肾脏称重，去除包膜，按冠状位纵行剖开，右肾立即置于Eppendorf液氮冷冻，随即于-80℃低温冰箱中保存，备提组织RNA，左肾置于中性甲醛固定，石蜡包埋，行HE、PAS染色。光镜观察肾小管问质改变，采用免疫组织化学染色测定肾小管间质P38MAPK、TGF-β1、Ⅳ型胶原蛋白和α-SMA蛋白表达，结果应用图象系统半定量分析。半定量反转录PCR检测P38MAPKmRNA及TGF-β1mRNA水平。 结果： 1各组动物尿量、肥大指数(肾重/体重)及生化指标的变化 实验6wk、10wk时糖尿病组(B组)与对照组(A组)相比体重分别下降(P＜0.01)，而肾重变化不明显(P＞0.05)，但肥大指数显著大于对照组(P＜0.01)，Glu、Scr、BUN、Ccr、Upro显著增高于对照组(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)；氯沙坦组(C组)与糖尿病组(B组)相比，体重增加，无明显差异(P＞0.05)肾重变化不明显(P＞0.05)，肥大指数无明显差异(P＞0.05)，血糖无明显变化(P＞0.05)，BUN、Scr、Ccr、Upro降低(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)；B组、C组大鼠的尿量显著多于A组，A组、B组、C组大鼠尿量无显著差异。 2光镜观察 HE和PAS染色A组未见异常；B组实验的第6周，肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，肾小管扩张，基底膜不规则增厚，肾间质小灶状淋巴单核细胞浸润，小灶状纤维化；第10周B组肾小管上皮细胞颗粒空泡变性更明显，肾小管明显扩张，肾小管萎缩、基底膜增厚，肾间质多灶状淋巴单核细胞浸润伴纤维化；C组与B组平行相比肾小管间质病变程度明显减轻。 3免疫组织化学检测 3.1P38MAPK A6组、A10组肾小管上皮细胞可见P38MAPK基础表达，A6组、A10组之间相比无差异；B6、B10P38MAPK在肾小管上皮细胞中表达量较A6、A10分别增高，有显著差异(P＜0.05)，并随着模型天数的延长而增加，B6与B10之间有显著差异(P＜0.05)；而C6与C10P38MAPK的表达量均显著低于同期的B组(P＜0.05)。 3.2TGF-β1A6组、A10组仅在肾小管上皮细胞有少量表达，A6组、A10组之间相比无差异；B6、B10的TGF-β1在肾小管上皮细胞，肾小球、肾间质中表达，且表达量较A6、A10分别增高，有显著差异(P＜0.05)，并随着模型天数的延长而增加，B6与B10之间有显著差异(P＜0.05)；而C6与C10TGF-β1的表达量均显著低于同期的B组(P＜0.05)。 3.3Ⅳ型胶原蛋白 A6组、A10组在肾小球、肾小管基底膜和系膜区可见Ⅳ型胶原蛋白微量表达，它们之间无显著差异；B6、B10上述区域的表达量较A6、A10分别增高，有显著差异(P＜0.05)，并随着模型天数的延长而增加，B6与B10之间有显著差异(P＜0.05)；而C6与C10Ⅳ型胶原蛋白的表达量均显著低于同期的B组(P＜0.05)。 3.4α-SMA蛋白 A6组、A10组在肾小球、肾小管基底膜和系膜区无α-SMA蛋白表达，只在正常肾组织血管上表达，它们之间无显著差异；B6、B10除血管壁上有表达外，可见肾小管上皮细胞胞浆中表达，肾间质细胞胞浆中也有表达，且表达量较A6、A10分别增高，有显著差异(P＜0.05)，并随着模型天数的延长而增加，B6与B10之间有显著差异(P＜0.05)；而C6与C10α-SMA的表达量均显著低于同期的B组(P＜0.05)。 4半定量PCR结果 4.1P38MAPKmRNA表达 A组P38MAPK基础表达；A6组、A10组之间无显著差异；B6、B10与A6、A10的P38MAPKmRNA相比分别增加，有显著差异(P＜0.05)，并随着模型天数的延长而增加，B6与B10组之间有显著差异(P＜0.05)；而C6与C10P38MAPKmRNA的表达量均显著低于同期的B组(P＜0.05)。 4.2TGF-β1mRNA表达 A组TGF-β1mRNA有少量基础表达，A6组、A10组之间无显著差异；B6、B10的TGF-β1mRNA的表达量较A6、A10分别增高，有显著差异(P＜0.05)，并随着模型天数的延长而增加，B6与B10之间有显著差异(P＜0.05)；而C6与C10TGF-β1mRNA的表达量均显著低于同期的B组(P＜0.05)。 结论： 1P38MAPK的信号转导通路参与了DM肾小管间质纤维化的发生和发展。本实验STZ诱导的糖尿病大鼠模型中，肾小管间质P38MAPK、TGF-β1的蛋白及mRNA表达水平明显增高，同时Ⅳ型胶原蛋白、α-SMA蛋白的表达也增高。 2动态观察STZ诱导的糖尿病大鼠模型肾小管间质的病理改变，肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，肾小管扩涨，基底膜不规则增厚及增厚，肾间质小灶状淋巴单核细胞浸润，灶状纤维化。 3氯沙坦能抑制DM大鼠肾小管间质P38MAPK、TGF-β1蛋白及mRNA的表达；下调肾小管间质Ⅳ型胶原蛋白和α-SMA蛋白的表达；减轻肾小管间质纤维化的程度，降低尿蛋白排泄量，改善肾功能，对DM大鼠肾脏具有保护作用。