目的糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病严重的慢性微血管并发症之一,根据中国肾脏病监控网络（China Kidney Disease Network,CK-NET）2019年发布的《中国肾脏病年度报告》数据显示,糖尿病肾病已超过肾小球肾炎,成为慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）的首位病因,占总体病因的27.0%。糖尿病肾病是一个异质性的疾病,目前的治疗策略包括严格的血糖、血压、血脂控制等多危险因素干预疗法。自从1994年肾素-血管紧张素系统抑制剂（renin angiotensin system inhibitor,RASI）卡托普利可以降低1型糖尿病患者的蛋白尿,2004年发现氯沙坦可以降低2型糖尿病患者的蛋白尿,保护肾功能外,没有其他药物证明可以降低糖尿病肾脏疾病的进展。直到2019年,Credence（Canagliflozin and Renal Events in Diabetes with Established Nephropathy Clinical Evaluation）研究发现卡格列净可以显著减少2型糖尿病伴肾病患者包括终末期肾脏病（end-stage renal disease,ESRD）、血清肌酐翻倍,肾脏或心血管疾病导致死亡在内的主要复合终点风险30%,使钠-葡萄糖协同转运蛋白2（sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT-2）抑制剂成为第二类有效的治疗糖尿病肾病的药物。SGLT-2主要分布在肾脏近曲小管S1段,是一种低亲和力、高转运能力的钠依赖性转运蛋白,其主要生理功能是在肾脏近曲小管完成肾小球滤过液中90%葡萄糖的重吸收。因此,SGLT-2抑制剂可以阻断近端小管对葡萄糖的重吸收从而通过尿液排出多余的葡萄糖,达到降低血糖的目的。SGLT-2抑制剂还可以通过减少近端肾小管钠盐的重吸收,通过管球反馈扩张肾脏入球小动脉,从而减少肾小球高滤过,降低血压,减少蛋白尿,发挥肾脏保护作用。SGLT2抑制剂治疗糖尿病肾病的潜在机制尚未完全阐明,目前认为可能与管-球反馈激活、改善缺氧、改善线粒体功能、减少炎症和纤维化以及改善内皮功能有关。在糖尿病中,SGLT-2的激活会增加肾脏近端小管细胞内的耗氧量,导致缺氧。缺氧的肾小管上皮细胞可激活相应的适应性过程以抵抗组织缺氧。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在调节组织对缺氧的反应中起主要作用。研究表明HIF-1α在肾小管上皮细胞中的过表达促进肾纤维化,抑制其表达可以阻止肾纤维化的进展并改善糖尿病肾病,但也有报道称HIF-1α的缺乏会加速小鼠的糖尿病肾病进展。因此,目前尚不明确HIF-1α在糖尿病肾病的发生和发展中到底具有保护作用还是有害作用。目前关于SGLT-2类药物对HIF-1α影响的研究结果不一致。1项达格列净的研究证实其可诱导HIF-1α表达,而在另一种SGLT2抑制剂鲁格列净的研究中发现其可降低肾小管上皮细胞中HIF-1α的表达。但目前尚无恩格列净对HIF-1α是否具有调节作用的报道。除SGLT-2外,葡萄糖还可以通过葡萄糖转运蛋白（GLUT）通过肾小管肾小管细胞基侧膜向血浆侧进行被动转运。有报道称GLUT-1的活性受HIF-1α的调节,但目前SGLT-2对于GLUT-1的活性的作用尚无报道。本研究中拟探讨高糖培养的肾小管上皮细胞HIF-1α的表达变化,以及具有高度选择性的SGLT2抑制剂恩格列净对HIF-1α及GLUT-1表达和高糖诱导的肾小管上皮细胞上皮间充质转分化（epithelial to mesenchymal transition,EMT）和纤维化的影响,为SGLT2的肾脏保护作用提供新依据。材料和方法1.近端肾小管上皮细胞的培养和处理永生化的近端肾小管上皮细胞（HK-2）细胞从中国模式培养中心购买。使用含有10%胎牛血清,1%青霉素（100u/ml）和链霉素（100ug/ml）的DMEM-F12培养基进行培养。将细胞置于37℃,含有5%CO₂中孵育并进行传代培养。培养基每48小时更换一次。当细胞密度达到80%后,将细胞接种于6孔板,培养基中分别含有5.5mM葡萄糖（正常糖组）、25mM葡萄糖（高糖组）、5.5mM葡萄糖+20mM甘露醇（高渗对照组）,并在37℃,含有5%CO₂中孵育24小时后收集。药物处理:当细胞密度达到50-60%时,将HK-2细胞暴露于5.5mM葡萄糖（正常糖组）或25mM葡萄糖（高糖组）的培养基中,将高糖组细胞分别用不同浓度恩格列净处理（50nM、100nM、500nM）,并在37℃,含有5%CO₂中培养72h后收集细胞。2 Western blot蛋白分析采用Western blot法。使用含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液处理细胞30分钟。所有试剂和裂解液均置于冰上。刮下培养皿上的贴壁细胞后,将裂解液转入不同的EP管,超声5次,每次持续3秒。细胞裂解液在1200rpm,4℃下离心20分钟,并于-80℃保存。使用BCA法测定蛋白样品浓度。将30ug总蛋白上样到含有8%分离胶和5%浓缩胶的泳道中,然后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析。随后,将样品转移至硝酸纤维素膜上。将膜在含有5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中摇晃封闭2小时。之后将膜用TBST缓冲液洗涤4次（每次5分钟）,并置于摇床上,在4℃与以下第一抗体孵育过夜:SGLT2 1:500,HIF-1α1:1000,GLUT-1 1:500,TGF-β1 1:1000,smad3 1:1000,p-smad3 1:1000,Collagen IV 1:2000,Fibronectin1:2000,E-Cadherin 1.2000,α-SMA 1:300,β-Actin 1:5000。将膜再次用TBST洗涤4次（每次5分钟）,然后与1:8000的抗兔IgG-辣根过氧化物酶连接的第二抗体在摇床上于室温孵育2小时。用TBST缓冲液洗涤后,使用化学发光生物成像系统（MF-ChemiBIS 3.2）来检测抗体结合。使用β-actin进行内参校正。使用ImageJ软件获得用于定量的光密度。3细胞增殖测定细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自Abbkine,根据说明书操作评估细胞增殖能力。将HK-2细胞接种到96孔板中,每组中有5个重复孔。用5.5mM葡萄糖,25mM葡萄糖和25mM葡萄糖加入不同浓度的恩格列净（50nM,100nM和500nM）处理细胞,并于37℃,含有5%CO₂中进行培养。分别在24小时、48小时和72小时,将具有无血清培养基的CCK-8溶液110ul加入到每个孔中,并于37℃,含有5%CO₂中培养2小时后用酶标仪在450nm处检测吸光度。4统计分析数据以至少3次独立实验的平均值±标准差表示。多组间比较采用单因素方差ANOVA分析和Tukey事后检验法。P值<0.05认为差异有统计学意义。结果1恩格列净对HIF-1α和葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）的影响:与正常糖组相比,高糖条件下HK-2细胞中HIF-1α蛋白表达没有显著增加。加入恩格列净后与未处理的高糖HK-2细胞相比较,HIF-1α蛋白表达量呈剂量依赖性增加（p<0.05）。同时,我们检测了HK-2细胞中HIF-1α介导的GLUT-1表达是否受高糖的影响。结果显示,高糖培养的HK-2细胞中GLUT-1蛋白表达轻度增加。与高糖培养的HK-2细胞相比,100nM恩格列净处理增加了GLUT-1蛋白表达（p<0.05）。2恩格列净对葡萄糖钠转运蛋白2（SGLT-2）的影响阻断近端肾小管上皮细胞中的钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT-2）,可以降低血糖,防止高血糖并发症的发生。本研究中我们检测了高糖及恩格列净治疗对HK-2细胞中SGLT-2表达的影响。我们发现高糖培养下,与正常糖相比SGLT-2蛋白的表达显著增加（p<0.05）。恩格列净处理可以且呈剂量依赖性降低SGLT-2蛋白的表达p<0.05)。3高糖培养的肾小管上皮细胞细胞外基质蛋白分泌增多细胞外基质蛋白堆积是糖尿病肾病的主要病理改变之一,导致肾小球硬化和肾间质纤维化。高糖培养的HK-2细胞中细胞外基质成分:纤维连接蛋白（FN）、胶原蛋白IV（Col IV）蛋白表达显著增加（p<0.05）。4恩格列净抑制TGF-β1/Smad3通路激活,抑制细胞外基质蛋白分泌恩格列净明显呈剂量依赖性减少高糖培养的HK-2细胞FN、Col IV蛋白的分泌。TGF-β1/Smad3信号通路的激活在上皮细胞间质转化中起重要作用,并介导肾脏纤维化。与正常糖相比,高糖培养的肾小管上皮细胞促纤维化细胞因子TGF-β1蛋白表达显著升高（p<0.05）,p-smad3表达显著增加（p<0.05）。高浓度恩格列净可显著降低高糖导致的p-smad3表达（p<0.05）。同时,恩格列净处理可显著降低高糖诱导的HK-2细胞中TGF-β1蛋白水平。而正常糖组、高糖组、恩格列净处理组中smad3表达均无明显变化。5恩格列净具有抑制上皮间质转分化（EMT）作用与正常糖组相比,高糖培养的肾小管细胞上皮细胞间充质转化标志物:α-SMA表达增加（p<0.05）。恩格列净可显著降低高糖诱导的α-SMA表达（p<0.05）,并以剂量依赖的方式逆转上皮E-钙黏蛋白表达下降。6恩格列净可抑制高糖诱导的HK-2细胞增殖。为探究恩格列净对肾脏的保护作用是否与抑制细胞增殖相关,我们采用CCK-8法评估细胞增殖程度。在24h、48h和72h高糖处理的HK-2细胞增殖明显高于正常糖组（P<0.0001）,并呈剂量依赖性。恩格列净可显著降低细胞增殖（P<0.0001）,并呈剂量依赖性和时间依赖性。4.讨论本研究旨在探讨SGLT-2抑制剂恩格列净对高糖诱导的近端肾小管细胞损伤的保护作用。结果表明,恩格列净降低了高糖诱导HK-2细胞中SGLT-2、EMT和纤维化标志物的表达,增加了E-钙粘蛋白的表达。另外,恩格列净增加高糖培养的HK-2细胞中HIF-1α和GLUT-1蛋白表达。这些发现表明,恩格列净的肾脏保护作用与调控HIF-1α和葡萄糖转运相关。恩格列净是一种口服降糖药,它可抑制近端肾小管细胞中钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT-2）,从而阻止葡萄糖的重吸收,促进尿糖排泄。在本研究中,我们分析了高糖是否会改变HK-2细胞中SGLT-2蛋白的表达。结果表明,高糖诱导HK-2细胞中SGLT-2表达水平增加,恩格列净以剂量依赖的方式显著降低SGLT-2的表达。另外,另一种SGLT-2抑制剂卡格列净也被报道可降低高糖诱导的小鼠系膜和肾近端小管细胞中SGLT-2的表达。这些结果表明,通过抑制和阻断钠-葡萄糖协同转运蛋白SGLT-2,可以改善血糖控制,并可逆转高血糖并发症。缺氧诱导因子HIF-1α是调节组织对缺氧反应的关键蛋白。目前关于高糖条件下肾脏HIF-1α表达裱花和SGLT2抑制剂的作用结果并不一致。有研究报道在高糖培养的肾小管上皮细胞中HIF-1α功能受到抑制,而达格列净进一步抑制HIF-1α的表达。而在高糖培养的小鼠系膜细胞中,HIF-1α表达增加。我们的结果表明,高糖培养的HK-2细胞HIF-1α表达无明显变化,这与Ryoichi等人的报道一致。提示糖尿病肾病状态下,尽管存在严重的肾脏缺氧,但HIF-1α的活性不增加,不能有效地纠正和代偿缺氧造成肾脏损伤。而恩格列净可显著增加高糖HK-2细胞中HIF-1α的蛋白表达,可能通过促进其下游靶基因GLUT1等的表达,改善缺氧导致的肾脏损伤。Smad3信号通路在TGF-β1诱导的EMT中起核心作用,降低其表达和活化可改善糖尿病小鼠的肾脏损伤。因此,我们观察了SGLT-2抑制剂是否影响近端肾小管上皮细胞中Smad3信号传导。结果表明,高糖培养的HK-2细胞中p-smad3的表达显著增加,500nM高浓度恩格列净处理显著降低了高糖诱导的p-smad3的表达,总smad3水平不受高糖及恩格列净处理的影响,这些结果表明磷酸化的smad3（p-smad3）的表达变化与肾脏纤维化相关。高糖培养的HK-2细胞中α-SMA的表达增加,500nM恩格列净处理显著降低了高糖诱导的HK-2细胞中α-SMA蛋白表达水平,并且恩格列净以剂量依赖性方式逆转了上皮标记物E-钙粘蛋白的下调。这些结果与糖尿病小鼠心脏研究中的结果相似,恩格列净显著降低了糖尿病小鼠心脏组织中α-SMA表达。本研究证明了恩格列净可逆转高糖诱导的肾小管上皮细胞的EMT。同时,我们发现恩格列净处理高糖培养的HK-2细胞时,细胞外基质蛋白ColⅣ,FN的表达减少。基于这些发现,我们推测恩格列净通过抑制SGLT-2,影响HIF-1α介导的TGF-β1/smad3磷酸化,减轻肾小管上皮细胞增EMT和细胞外基质蛋白分泌,从而减轻肾脏纤维化的发生和发展。糖尿病肾病的进展与细胞异常增殖和功能失调密切相关。因此,我们检测了恩格列净的肾脏保护作用是否与细胞增殖有关。恩格列净处理显著降低了高糖诱导的HK-2细胞的增殖。与卡格列净抗糖尿病小鼠系膜细胞的增殖作用相似。因此,恩格列净对肾脏保护作用可能也与调控细胞生长和增殖有关。结论1.高糖培养的肾小管上皮细胞SGLT2表达上调,TGF-β1,p-Smad3活性增加,α-SMA表达增加,E-Cdherin的表达下降,肾小管上皮细胞发生EMT,细胞外基质蛋白FN和ColⅣ的分泌增加,而HIF-1α的表达无变化。2.恩格列净可降低高糖培养的HK-2细胞中SGLT-2的表达,诱导HIF-1α的表达并提高了GLUT-1的表达,抑制TGF-β1/p-Smad3的激活,减少α-SMA的表达,并逆转E-钙粘蛋白的下调,抑制肾小管上皮细胞EMT,减少细胞胞外基质蛋白（FN,ColⅣ）的分泌。恩格列净诱导的HIF-1α表达可能在高糖引起的近端肾小管细胞损伤中起保护作用,提示SGLT2的潜在肾脏保护机制可能与改善缺氧反应相关。