研究背景近年来的流行病学调查和实验研究均提示:低出生体重不仅是造成围产儿死亡和发病的重要原因,而且还是成年后心血管疾病、糖代谢异常等代谢综合征(metabolic syndrome,MS)的独立发病因素。因此研究低出生体重引起成年期MS的发病机制并实施相应的干预来早期防治成年期疾病已成为一个研究热点。对低出生体重发生成年期MS的机制已进行了一些研究,但其中机制并未完全明确。2型糖尿病是组成MS的主要疾病之一,它的主要发病机制包括胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能障碍。近年来研究发现,氧化损伤在糖尿病及其并发症的发生、发展中起重要作用,氧化损伤可以可以导致胰岛β细胞损伤并导致胰岛素抵抗。氧化和抗氧化作用失衡所致的氧化损伤引起的胰岛β细胞损伤是糖尿病发生、发展的一个重要机制。氧化损伤是指机体在遭受各种有害刺激时,氧自由基的产生和抗氧化防御之间严重失衡,从而导致组织损伤,包括生物膜脂质过氧化、细胞内蛋白及酶变性、DNA损害,最后导致细胞死亡或凋亡、疾病发生。在糖尿病早期,患者胰岛附近的脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的浓度明显增高,证实氧自由基在糖尿病的发病中起作用。目前对有关氧化损伤机制在低出生体重儿发生代谢综合征的过程中是否发挥作用及其作用机制尚缺乏研究。从氧化损伤这一独特视角来探讨低出生体重儿在发生MS过程中的作用及机制并进行相应预防具有重要意义。营养素是基因表达的重要调节因子,它可通过控制代谢产物或代谢状态导致mRNA、蛋白质的合成与功能改变。胰腺在发育的关键时期同样对营养不良敏感,充足的营养对维持发育期胰岛的正常形态和功能是必要的。作为一种发育期重要的必需氨基酸—L-精氨酸,已应用于胎儿宫内发育迟缓的临床治疗,它具有改善胎盘功能、促进胎盘转运氨基酸的作用;有研究发现L-精氨酸能促进胰岛素分泌,可作为糖尿病的辅助治疗;还有研究发现L-精氨酸能通过提高抗氧化酶SOD的活性而减轻过氧化损伤。但作为一种抗氧化营养素,L-精氨酸对低出生体重仔鼠胰腺功能及结构的影响尚缺乏研究。目的(1)本实验给予孕鼠10%低蛋白饮食,制造低出生体重仔鼠模型,动态监测低出生体重仔鼠的生长发育情况。(2)动态研究低出生体重仔鼠生后2～3月内的胰岛功能与结构的变化:包括血糖水平、血清胰岛素水平、胰腺胰岛素蛋白含量和β细胞超微结构的变化,并根据血糖与血清胰岛素值计算胰岛β细胞分泌功能。(3)研究低出生体重仔鼠体内的氧化损伤状态;并进行脂质过氧化产物MDA与胰岛β细胞功能之间的相关性研究,以揭示氧化损伤能否导致胰岛β细胞损伤。(4)研究氧化损伤导致胰岛β细胞功能与结构改变的机制。(5)探讨L-精氨酸作为抗氧化营养素对低出生体重仔鼠促生长发育的影响;对胰岛细胞功能及结构、对胰岛素分泌的影响;进一步从减轻过氧化损伤、促进胰岛素合成和分泌、减少胰岛细胞凋亡及促进胰岛β细胞定向分化这几个方面,揭示L-精氨酸影响低出生体重仔鼠胰岛功能和结构的作用机制。方法(1)低出生体重仔鼠模型的建立和实验分组:采用健康三月龄SD二级雌性和雄性大鼠各18只,按照雌雄1:1的比例同一笼中交配。将孕鼠分成三组:①孕期给予10%低蛋白饲料制造低出生体重仔鼠模型(模型组;M组),M组在产后21天哺乳期内给予母鼠正常蛋白饲料喂养;②正常对照组(正常组,C组),母鼠在孕期及哺乳期内一直给予21%正常蛋白饲料喂养;③模型干预组(干预组,MT组),部分低出生体重仔鼠在产后21天哺乳期内给予母鼠富含L-精氨酸(200mg/kg/d)的饮用水喂养。其它两组母鼠自由饮水。观察各组新生仔鼠数目、平均出生体重、IUGR发生率及围产期死亡率。(2)低出生体重仔鼠胰岛功能、结构的检测:在仔鼠生后7天、21天、2月龄或3月龄这几个时间点分别杀鼠取材,检测以下指标:①测体重,取血测空腹血糖及胰岛素值;并根据公式计算胰岛β细胞分泌功能。②取胰腺,用免疫组化法及WB方法分别检测Insulin蛋白的表达及其水平。③制作胰腺电镜标本,电镜下观察胰岛β细胞的超微结构。(3)低出生体重仔鼠氧化损伤状态及抗氧化酶的检测:①取血清检测脂质过氧化物MDA及抗氧化酶SOD、GSH-PX的水平。②制作胰腺匀浆、心肌匀浆及脑组织匀浆,分别检测MDA、SOD及GSH-PX的水平。③进行脂质过氧化产物MDA水平与3月龄血糖值、胰岛素蛋白水平和胰岛β细胞分泌功能的相关性分析。(4)氧化损伤机制对胰岛功能、结构影响的作用机制研究:①取胰腺,用免疫组化法及WB方法分别检测NF-κB蛋白在胰腺中的表达及其水平。②采用RT-PCR方法检测胰腺组织的Insulin、Bax及Bcl-2基因的mRNA表达。(5)L-Arg干预后对低出生体重仔鼠生长的影响及对胰岛功能与结构的影响和机制研究:①动态监测仔鼠的体重增长情况;②测血糖及胰岛素值,计算胰岛β细胞分泌功能;③检测血清MDA、SOD、GSH-PX及NO水平;④取胰腺,分别用免疫组化法和WB方法检测Insulin蛋白、NF-κB蛋白及PDX-1蛋白的表达及其水平;⑤取胰腺,用RT-PCR法测Insulin、Bax及Bcl-2基因的mRNA表达;⑥电镜下观察胰岛β细胞的超微结构。(6)统计学方法:采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差((?)±s)表示,两组间均数比较采用t检验。样本间率的比较采用卡方检验。相关性分析采用Bivariate直线相关分析,计算Pearson相关系数。P＜0.05视为差异有显著性。结果(1)建立了低出生体重仔鼠模型:10%低蛋白饲料喂养孕鼠,可使其仔鼠出生体重下降,且较多达到IUGR的标准;而且每窝产仔数和围产期死亡率较正常组无明显差异。低出生体重仔鼠在生后2月内体重一直低于正常组,但随后出现快速的体重增加,生后3月龄时低出生体重仔鼠体重已追赶上正常组。(2)低出生体重仔鼠胰岛功能、结构的变化:①模型组3月龄时出现明显的空腹高血糖症。②正常组和模型组两组间各时间点的血清胰岛素水平无显著性差异;但模型组在生后2月龄及3月龄时胰岛β细胞分泌功能明显弱于正常组。③各时间点的低出生体重仔鼠Insulin蛋白水平均显著低于正常组;低出生体重仔鼠胰腺的Insulin mRNA的表达水平明显低于正常组。④胰腺超微结构显示,低出生体重仔鼠生后2月龄时胰岛β细胞的内分泌颗粒明显减少,并出现脱颗粒和苍白颗粒现象。(3)脂质过氧化产物MDA及抗氧化酶的检测:①各时间点的低出生体重仔鼠血清MDA值均显著高于正常组;低出生体重仔鼠的血清SOD、GSH-PX值均显著低于正常组。②检测胰腺、心肌及脑组织匀浆亦有类似结果。(4)氧化损伤状态与胰岛内分泌功能之间的相关性:通过相关性分析,发现血清及胰腺匀浆MDA值与大鼠生后3月龄血糖值之间存在明显正相关;血清及胰腺匀浆MDA值与大鼠生后2月龄胰岛素蛋白水平和胰岛β细胞分泌功能之间存在明显负相关。(5)氧化损伤机制对胰岛功能、结构影响的作用机制研究:①低出生体重仔鼠胰腺核因子NF-κB蛋白水平明显高于正常组。②低出生体重仔鼠胰腺的抑制凋亡基因Bcl-2 mRNA的表达水平明显低于正常组;促凋亡基因Bax mRNA的表达水平高于正常组。(6)L-Arg干预后对低出生体重仔鼠生长及氧化损伤状态的影响:①于生后早期给予L-Arg干预治疗后,可使低出生体重仔鼠出现生长追赶现象。至生后21天、2月龄时,干预组的体重与正常组相比已无显著性差异。②L-Arg干预治疗后,可以使低出生体重仔鼠的血清MDA水平下降,并能增加血清SOD的含量。③正常组血清一氧化氮(NO)水平最高,模型组最低。L-Arg干预后能增加低出生体重仔鼠的血清NO水平,使其在生后21天及2月时接近正常组仔鼠的NO水平。(7)L-Arg干预后对低出生体重仔鼠胰腺功能、结构的影响和机制研究:①生后2月龄时,干预组大鼠胰岛β细胞分泌功能较模型组有明显改善,已接近于正常组。②干预组大鼠在生后21天及2月时Insulin蛋白及Insulin mRNA表达水平较模型组均有明显增加。③2月龄时,模型组PDX-1蛋白含量最低;L-Arg干预后可以促进低出生体重仔鼠的PDX-1蛋白表达,使其接近于正常组水平。④模型组大鼠胰腺NF-κB p65蛋白的表达最强,正常组NF-κB p65蛋白的表达最弱;L-Arg干预后可以降低低出生体重仔鼠的NF-κB p65蛋白表达。⑤L-Arg干预可以上调大鼠胰腺Bcl-2 mRNA的表达,下调BaxmRNA的表达。⑥L-Arg早期干预后,可明显增加低出生体重仔鼠的胰岛β细胞内分泌颗粒,减少脱颗粒及苍白颗粒现象。结论(1)10%低蛋白饲料喂养孕鼠,是一种有效的制造低出生体重仔鼠模型的方法。生后3月龄时,低出生体重仔鼠出现体重快速增加、空腹血糖值增高,有发生成年期代谢综合征的倾向。(2)生后2月龄及3月龄时,模型组大鼠的胰岛β细胞分泌功能降低;Insulin蛋白及Insulin mRNA水平低于正常组;出现胰岛β细胞超微结构的改变,表现为内分泌颗粒明显减少。提示低出生体重仔鼠存在胰岛功能的损伤和超微结构的改变。(3)模型组大鼠体内的过氧化损伤严重,抗氧化酶水平低下。相关性分析表明机体的氧化损伤状态与其成年期高血糖症之间具有显著的正相关性,与机体的胰岛素合成、分泌功能低下之间具有显著的负相关性,说明氧化损伤导致了胰岛β细胞的功能受损。提示氧化损伤机制在低出生体重仔鼠发生成年期代谢综合征的过程中起重要作用。(4)低出生体重仔鼠存在NF-κB p65蛋白水平升高,并出现促凋亡基因Bax mRNA表达的增强和抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表达的减弱。提示氧化损伤对胰岛功能和结构的影响与NF-κB蛋白的激活、Bcl-2/Bax平衡的改变而导致的胰岛细胞凋亡增多有关。(5)生后早期补充L-Arg对低出生体重仔鼠具有促生长追赶的作用。(6)生后早期补充L-Arg可以通过增强抗氧化酶SOD的活性和增加血清NO的水平来减轻机体的过氧化损伤。相关性分析提示L-Arg可能通过减轻机体的过氧化损伤状态而改善胰岛β细胞分泌功能。(7)生后早期补充L-Arg可从促进Insulin的表达、抑制NF-κB蛋白的表达、调节凋亡相关基因Bcl-2/Bax的比例、减少胰岛细胞的凋亡以及通过上调PDX-1蛋白的表达来促进β细胞定向分化这几个方面机制来发挥改善胰岛内分泌功能和结构的效应。