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糖尿病性心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者常见的心血管并发症,它独立于高血压性心脏病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、心脏瓣膜病及其他心脏病变的心肌疾病。心肌纤维化(Myocardial fibrosis,MF)是引发DCM的最主要原因之一,而糖尿病性心肌纤维化(Diabetic myocardial fibrosis)的发生机制尚不明确。近年来,微小RNA(microRNA,miRNA)在基因表达调控中的作用越来越引起人们的重视。miRNA广泛存在于动植物中,参与细胞增殖、分化、凋亡、胚胎发育、形态建成以及一系列疾病的发生、发展过程。已有研究显示,miRNAs参与了心肌纤维化的过程。本文将对糖尿病性心肌中miRNAs表达谱进行分析,筛选表达变化显著的miRNAs,研究其在糖尿病性心肌纤维化中的可能作用,为进行基于microRNAs的心肌纤维化治疗研究提供科学依据。 目的：利用II型糖尿病db/db小鼠和db/m对照小鼠,新生乳C57BL/6小鼠心肌细胞,检测db/db和db/m小鼠心肌组织中miRNA表达谱变化,筛选显著上调的miRNA做进一步功能研究,试图揭示其在糖尿病性心肌纤维中的作用机制。 方法：(1)利用16周龄雄性II型糖尿病模型db/db小鼠和db/m对照小鼠,检测外周血血糖和胰岛素水平,进行葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验,利用小动物B超检测其心脏结构和功能状况。 (2)利用miRNAs表达谱芯片,检测db/db及db/m小鼠心肌组织中miRNAs表达变化,利用荧光实时定量PCR(qPCR)鉴定差异表达的miRNAs。 (3)利用差速贴壁法分离出生1d~3d的乳C57BL/6小鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞,利用传至第3代的心肌成纤维细胞进行细胞学实验。 (4)利用Masson染色、qPCR、Western blot等方法检测心肌组织中胶原水平及纤维化相关基因Col1a1、Col3a1、TGF-β1、CTGF、α-SMA等的表达。 (5)利用AngⅡ、TGF-β1和高糖/葡萄糖氧化酶(G/GO)处理心肌细胞和心肌成纤维细胞,检测miR-208b的表达变化。 (6)分别利用miR-208b模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor)转染心肌成纤维细胞,用qPCR、Western blot方法检测纤维化相关基因Col1a1、Col3a1、α-SMA等的表达。 (7)分别利用双荧光报告基因系统检测miR-208b与候选靶基因Mtf2、Pgrmc1的3’UTR的结合能力。对比miR-208b mimic,研究Mtf2 siRNA、Pgrmc1 siRNA修饰的小鼠心肌成纤维细胞中纤维化相关基因的表达情况。 (8)研究调控糖尿病条件下小鼠心肌成纤维细胞中miR-208b表达的信号通路。 结果：(1)小动物心脏B超结果显示,对比db/m小鼠,db/db小鼠心脏左室出现收缩、舒张功能障碍和心室结构改变。 (2)Masson染色结果显示,db/db小鼠心肌细胞间质和微血管周围胶原沉积显著增加,db/db小鼠心肌中Col1a1、Col3a1、CTGF等纤维化相关基因的表达显著上调。 (3)Western blot检测发现,磷酸化Smad3水平在db/db小鼠心肌组织中显著升高,Smad3信号通路处于激活状态。 (4)microRNA表达谱芯片结果显示,对照db/m小鼠,db/db小鼠心肌中多个miRNAs出现差异性表达,经qPCR验证,其中明显下调的miRNA有let-7g、miR-142、miR-29b、miR-30e等,而miR-208b在db/db小鼠心肌组织中表达升高最显著。 (5)在细胞水平,利用AngⅡ、TGF-β1和高糖/葡萄糖氧化酶(G/GO)处理小鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞,发现miR-208b表达均呈剂量依赖性升高。 (6)采用miR-208b mimic处理乳小鼠心肌成纤维细胞,发现miR-208b可特异上调Col1a1、α-SMA及CTGF的表达。 (7)双荧光报告基因系统检测结果表明,miR-208b可抑制候选靶基因Mtf2和Pgrmc1的表达。利用siRNA分别沉默心肌成纤维细胞中Mtf2和Pgrmc1表达后,发现纤维化相关基因表达增加,与miR-208b mimic作用效果一致。 (8)AngⅡ、TGF-β1可激活心肌成纤维细胞中Smad3信号通路上调miR-208b表达,而抑制Smad3可降低miR-208b表达。 结论：(1)发生纤维化的16周龄糖尿病db/db小鼠心肌中出现miRNAs的差异性表达变化。miR-208b在db/db小鼠心肌中表达显著升高,而在细胞水平上,AngⅡ、TGF-β1和G/GO均可诱导心肌细胞和心肌成纤维细胞中miR-208b表达升高。 (2)荧光定量PCR和Western blot检测证实,miR-208b mimic可特异上调心肌成纤维细胞中Col1a1、Col3a1、CTGF等纤维化相关基因的表达,而miR-208b inhibitor的作用相反。 (3)miR-208b可在转录后水平调控靶基因Mtf2和Pgrmc1表达,Mtf2和Pgrmc1介导了miR-208b调控的心肌成纤维细胞中Col1a1、Col3a1和CTGF的表达。 (4)糖尿病性小鼠心肌和AngⅡ、TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞中Smad3信号通路激活,抑制心肌成纤维细胞中Smad3活性,miR-208b表达降低。Smad3信号通路调控了心肌成纤维细胞中miR-208b的表达。