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背景雷帕霉素目前在肾脏病治疗方面主要作为免疫抑制剂应用于肾移植术后患者,它能明显改善移植物的生存,但有一个明显的副作用,即高脂血症。另一方面,又有研究发现,雷帕霉素具有抗动脉粥样硬化的作用,其机理之一可能是减少血管局部巨噬细胞内胆固醇的积聚从而减少泡沫细胞形成。肾小球硬化在某些方面与动脉粥样硬化存在相似的发病机理,减少肾小球细胞内脂质的过度积聚是延缓肾小球硬化发展的一个颇具吸引力的治疗靶点。细胞内脂质含量与细胞对脂质的摄入及排出等多种因素有关,肾小球系膜细胞(HMC)可表达低密度脂蛋白受体(LDLR),介导细胞对低密度脂蛋白(LDL)的摄取,表达ATP结合盒转运子A1(ABCA1),介导细胞内胆固醇的流出,ABCA1的表达受过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和肝X受体α(LXRα)的调节。正常情况下,肾小球细胞内的脂质含量是受严格调控的,但诸如炎症等多种病理机制可引起细胞内脂质过度积聚,形成泡沫细胞。本研究观察雷帕霉素对肾小球系膜细胞内脂质稳态的影响并从雷帕霉素对细胞摄取及排出脂质途径的调节上探讨其可能机制,旨在为雷帕霉素在临床的进一步应用提供一定的实验依据。目的观察雷帕霉素对基础状态及炎症状态下肾小球系膜细胞内脂质稳态的影响及探讨其机制。方法以肾小球系膜细胞株(HMCL)为实验对象,采用油红O染色及高效液相色谱分析法(HPLC)定性及定量观察不同浓度雷帕霉素对对基础状态下及IL-1β作用后细胞内脂质含量的影响;实时荧光定量PCR法及Western印迹法分别检测不同浓度雷帕霉素对基础状态下及IL-1β作用后的HMCL LDLR、ABCA1mRNA及蛋白表达的影响。实时荧光定量PCR法检测不同浓度雷帕霉素对基础状态下及IL-1β作用后的HMCL细胞PPARy和LXRamRNA表达的影响及阻断PPARγ和LXRα作用后雷帕霉素对HMCL细胞ABCA1mRNA表达的影响。利用脂质体转染的方法探讨雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在雷帕霉素影响HMCL细胞ABCAlmRNA表达中的作用。结果1、基础状态下200μg/ml LDL孵育HMCL,细胞内可有少量胆固醇积聚,不同浓度雷帕霉素与200μg/ml LDL共同孵育细胞,油红0染色检查未发现细胞内脂滴与对照组之间有明显差别;IL-1β5ng/ml能明显增加细胞内脂滴含量,雷帕霉素在10-100 ng/ml浓度范围内均能减少IL-1β引起的细胞内脂滴的增加。2、HPLC定量测定示各雷帕霉素处理组细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)、胆固醇酯(CE)的浓度均与对照组相比差异无统计学意义;IL-1β处理组细胞内TC及CE的浓度分别为对照组的1.43±0.14、2.49±0.93倍,较对照组显著增加,差异有统计学意义(P＜0.05),10、50、100ng/ml浓度雷帕霉素组细胞内TC含量分别为对照组的0.87±0.05、1.16±0.16、0.96±0.03倍,CE含量分别为对照组的1.12±0.10、1.58±0.29、1.53±0.60倍,较IL-1β处理组细胞内TC及CE浓度显著减少,差异有统计学意义(P＜0.05),各浓度雷帕霉素之间效果差异无统计学意义,各组细胞内FC含量差异无统计学意义。3、雷帕霉素时间依赖性地调节LDLRmRNA的表达。100ng/ml雷帕霉素作用2小时,LDLRmRNA表达上调,为0小时时的2.06±0.03倍(P＜0.01),之后LDLRmRNA表达迅速下调,在8小时时LDLRmRNA的表达量达到最低,为0小时时的0.45±0.03倍(P＜0.01),24小时与8小时LDLRmRNA表达量无明显差异。雷帕霉素作用2h、4h、8h、24h LDLR蛋白表达量均与0小时无明星差异。4、在作用24小时时,雷帕霉素剂量依赖性地下调LDLRmRNA的表达。10ng/ml、50ng/ml及100ng/ml组LDLRmRNA表达量分别为对照组的0.47±0.06、0.34±0.04、0.38±0.06倍,均较对照组显著降低(P＜0.01),其中50ng/ml作用最明显,100ng/ml与50ng/ml无明显差异。各剂量雷帕霉素作用24小时时LDLR蛋白表达量与对照组无明显差异。5、IL-1β显著上调HMCL LDLRmRNA及蛋白的表达(P＜0.01),加用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素后LDLR mRNA及蛋白表达量呈剂量依赖性地下降,均较IL-1β单独作用组显著下调(P＜0.01),其中以100ng/ml作用最明显。6、100ng/ml雷帕霉素时间依赖性地调节HMCL细胞ABCA1mRNA及蛋白的表达,在2小时时ABCA1mRNA及蛋白表达较0小时时显著下调(P＜0.01),之后逐渐上调,在8小时时达到高峰,较0小时时显著增高(P＜0.01),24小时ABCA1mRNA及蛋白表达接近0小时水平。7、在8小时时,雷帕霉素能剂量依赖性地上调ABCA1mRNA及蛋白的表达。10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素作用后组ABCA1mRNA及蛋白表达量均较对照组显著增加(P＜0.01),mRNA水平以其中100ng/ml作用最明显,蛋白水平以50ng/ml作用最明显。8、IL-1β明显下调ABCA1mRNA及蛋白的表达(P＜0.01),加用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素后ABCA1mRNA及蛋白表达量呈剂量依赖性地增加。在mRNA水平,各剂量组ABCA1表达均较IL-1β单独作用组显著增加(P＜0.01),不同浓度组之间两两比较有统计学差异(P＜0.01),以100ng/ml组作用最明显。在蛋白水平,50ng/ml、100ng/ml组较IL-1β单独作用组ABCA1表达显著增加(P＜0.01),10ng/ml组与IL-1β单独作用组无明显差异。9、100ng/ml雷帕霉素时间依赖性地调节HMCL细胞PPARγ及LXRαmRNA的表达,2小时时二者表达下调,分别为0小时时的0.63±0.04、0.49±0.04倍,与0小时相比有显著性差异(P＜0.01),之后逐渐上调,8小时时二者表达量达高峰,较0小时显著增加(P＜0.01),分别为0小时时的2.42±0.05、1.99±0.06倍,24小时PPARγmRNA表达量降至接近0小时水平,LXRamRNA表达量降至0小时时的1.68±0.04,仍较后者显著增加(P＜0.01)。10、在8小时时,雷帕霉素剂量依赖性地上调PPARγ、LXRαmRNA的表达,10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml组PPARγmRNA表达量分别为对照组的1.57±0.03、1.76±0.04、1.92±0.06倍,LXRαmRNA表达量分别为对照组的1.45±0.05、1.73±0.07、1.34±0.04倍,均较对照组显著增加(P＜0.01)。11、IL-1β明显下调PPARγ、LXRαmRNA的表达,分别为对照组的0.41±0.05、0.25±0.04倍(P＜0.01),加用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素后PPARγ、LXRαmRNA表达量均呈剂量依赖性地增加,PPARγmRNA表达量分别为对照组的0.39±0.05、0.78±0.04、1.04±0.04倍,其中50ng/ml、100ng/ml雷帕霉素组较IL-1β单独作用组显著增加(P＜0.01);LXRαmRNA表达量分别为对照组的0.55±0.03、0.54±0.06、0.78±0.04倍,均较IL-1β单独作用组显著增加(P＜0.01),不同浓度组之间两两比较有统计学差异(P＜0.01)。12、100ng/ml雷帕霉素显著上调ABCA1mRNA的表达,为空白对照组的1.98±0.04倍(P＜0.01),PPARγ阻断组ABCA1 mRNA的表达仍显著上调,为空白对照组的2.03±0.06倍(P＜0.01),与雷帕霉素对照组无显著差异;LXRα阻断组ABCA1 mRNA的表达为空白对照组的0.81±0.03倍,较空白对照组及雷帕霉素对照组均显著下调(P＜0.01)。13、转染mTOR-WT、mTOR-RR、mTOR-RR-KD的细胞ABCA1 mRNA表达量较转染pcDNA3的细胞ABCA1 mRNA表达量显著降低(P＜0.01),分别为后者的0.53±0.04、0.59±0.03、0.61±0.03倍;雷帕霉素作用后,转染pcDNA3、mTOR-WT、mTOR-RR、mTOR-RR-KD的细胞的ABCAl mRNA表达量分别为转染pcDNA3无雷帕霉素作用组细胞的1.74±0.04、0.80±0.06、0.92±0.06、0.87±0.03倍,均较转染相应质粒而无雷帕霉素作用组ABCA1 mRNA表达量显著增高(p＜0.01)。结论在本实验条件下:1.雷帕霉素对正常状态下HMCL内脂质稳态无明显影响,但能明显改善炎症状态下HMCL内脂质稳态;2.雷帕霉素能通过调节脂质流入细胞途径LDLR及流出细胞途径PPARγ-LXRα-ABCA1的表达而改善炎症状态下HMCL内脂质稳态;3.雷帕霉素通过对LXRα的调节来影响ABCA1的表达,而PPARγ并非雷帕霉素影响ABCA1表达的唯一途径。4.mTOR能抑制ABCA1的表达,而雷帕霉素对HMCLABCA1表达的调节可能不完全是通过mTOR来实现的。