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研究背景:人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持续感染可以引起皮肤粘膜疣样病变,宫颈癌、外阴癌、肛门癌和头颈部肿瘤等多种良性或恶性疾病。宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,发病率占女性肿瘤第二位,约70%宫颈癌患者与HPV 16/18型有关。预防HPV感染的疫苗已于2006年开始应用,但此类疫苗仅适用于从未感染的健康个体,对现症HPV感染及其所致疾病无效。尖锐湿疣(Genital Warts)是由HPV感染引起的以疣状病变为主的常见性传播疾病,是我国第二大性传播疾病,约占所有性传播疾病的16%,大约有40种亚型的HPV可导致尖锐湿疣,90%以上的尖锐湿疣有HPV6/11亚型引起,至今没有一种治疗方法或药物能根除尖锐湿疣。病毒或肿瘤治疗性疫苗通过诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTLs)特异性杀死肿瘤或病毒感染细胞。HPV16 E7长肽免疫时阻断白介素10(IL-10)能够比不阻断白介素10诱导产生更多的特异性CTLs,并浸润到肿瘤组织,但对肿瘤生长抑制作用甚微,提示肿瘤微环境抑制HPV治疗性疫苗的疗效。从两栖动物皮肤分泌物分离出的天然多肽caerin可以通过Tec激酶信号传导和LXR/RXR通路引起急性炎症和促进多种肿瘤细胞凋亡。在本课题研究中,假设caerin多肽体内具有杀伤肿瘤的能力,可以提高含白介素10抑制剂的HPV治疗性疫苗疗效。我首先研究了caerin多肽体内外对HPV+细胞的杀伤作用,并且制备caerin多肽温敏性凝胶,研究该凝胶对体内外肿瘤抑制作用,最后,研究caerin多肽是否能够提高HPV治疗性疫苗疗效。结果表明:1、Caerin 1.1(F1),caerin 1.9(F3)和caerin 1.1/1.9(质量比50:50,F1/F3)多肽在5μg/ml浓度时开始对HPV16+TC-1细胞增殖有抑制作用(P<0.05),在10μg/ml浓度时明显对TC-1细胞增殖有抑制作用(P<0.01),且对正常HUVEC细胞没有生长抑制作用(P>0.05),对照P3多肽对TC-1和HUVC细胞的增殖无影响(P>0.05)。2、采用Annexin-V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测不同浓度caerin 1.1、caerin 1.9、caerin 1.1/1.9和P3处理24小时后TC-1细胞的凋亡情况。与P3和未治疗对照组相比,caerin 1.1和caerin 1.9在5μg/ml和10μg/ml时能够显著促进TC-1细胞凋亡。3、F1/F3在体内可抑制TC-1肿瘤的生长。C57BL/6小鼠皮下种植TC-1细胞。4天后,连续7天瘤内注射将30μg的F1/F3,P3或PBS。测量肿瘤大小,并在实验结束后分离肿瘤称重。结果表明,F1/F3能够抑制TC-1肿瘤的生长,而P3多肽或PBS却不能。4、成功制备了caerin多肽温敏性凝胶(F1/F3凝胶),F1/F3凝胶具有无菌性、低/无吸水性、pH值偏中性等物理特性。5、研究了凝胶中的F1/F3是否具有生物活性。我对比PBS中的F1/F3与凝胶中的F1/F3,F1/F3凝胶具有抑制肿瘤细胞生长的活性。在5μg/ml和10μg/ml溶度时,与PBS中的F1/F3无统计学差异(F1/F3凝胶vs F1/F3,P>0.05)。但有趣的是,当浓度达到15μg/ml时,与PBS中F1/F3比较,F1/F3凝胶对肿瘤细胞的抑制作用更加显著(F1/F3凝胶vs F1/F3,P<0.05),空白基质(Gel only)和P3凝胶不抑制TC-1肿瘤细胞生长,与未处理组无统计学差异(P>0.05,ns)。6、用噻唑蓝比色法(MTT法)探究F1/F3凝胶性质的稳定性,发现将F1/F3凝胶密封放置在4℃存储5月和常温保存1月后仍在5μg/ml浓度具有抑制肿瘤生长的活性。7、进一步探究F1/F3凝胶是否可在体内抑制肿瘤生长。设置凝胶中的F1/F3、PBS中的F1/F3、空白基质和PBS四组。局部注射7天,凝胶中的F1/F3与PBS中F1/F3对肿瘤生长均有抑制作用,且两者没有差别(F1/F3凝胶vs F1/F3,P>0.05),与PBS和空白基质作用TC-1肿瘤有显著统计学差异(F1/F3凝胶vs PBS,P<0.01或者F1/F3凝胶vs gel only,P<0.01)。局部注射空白基质(Gel only)在小鼠体内也不具有抗肿瘤活性(PBS vs gel only,P>0.05)。8、进一步探究局部涂抹F1/F3凝胶是否对TC-1肿瘤生长有抑制作用。首先将荷瘤小鼠分为7组,分别是Untreated,Gel only,P3凝胶,F1/F3凝胶,5%Imiquimod cream,5%Imiquimod+Gel only(交替使用5%咪喹莫特和gel only进行治疗),5%Imiquimod+F1/F3凝胶(交替使用5%咪喹莫特和F1/F3凝胶进行治疗)。实验结果显示F1/F3凝胶能够抑制肿瘤生长(F1/F3凝胶vs Untreated,P﹤0.01),联合5%Imiquimod软膏(艾达乐)对TC-1肿瘤生长的抑制作用更加显著(F1/F3gel+Imiquimod vs Untreated,P﹤0.001),局部应用空白基质(Gel only)在小鼠体内不具有抗肿瘤活性(gel only vs Utreated,P>0.05),有趣的是应用F1/F3凝胶联合咪喹莫特软膏组肿瘤大小比单用F1/F3凝胶组的肿瘤要小,但统计学上并无差异。9、为了探究F1/F3凝胶抑制肿瘤生长的机制。用流式细胞术分析了F1/F3凝胶、P3凝胶、Untreated三个组的肿瘤浸润T细胞和NK细胞情况,结果显示F1/F3凝胶组的肿瘤大小明显小于Untreated组(F1/F3凝胶vs Untreated,P<0.01),且肿瘤内浸润T细胞和NK细胞情况明显高于未处理组(P<0.01),P3凝胶组与未处理组没有差别。10、探究Caerin多肽是否提高含白介素10抑制剂的HPV治疗性疫苗Ex/MPLA/α-IL10R(Ex为HPV16 E7全长的4个重叠多肽)的效率。将携带TC-1肿瘤小鼠随机分为4组:1)治疗性疫苗Ex/MPLA/α-IL10R免疫和caerin 1.1/1.9肿瘤局部注射;2)Ex/MPLA/α-IL10R免疫和PBS肿瘤局部注射;3)仅caerin 1.1/1.9肿瘤局部注射和4)仅PBS肿瘤局部注射。TC-1荷瘤小鼠免疫两次,然后连续7天肿瘤内注射caerin1.1/1.9或PBS。结果表明,Ex/MPLA/α-IL10R免疫以及局部应用caerin多肽显著延长TC-1荷瘤小鼠的存活时间。与PBS处理的对照组相比,单独用Ex/MPLA/α-IL10R免疫或单独局部注射caerin多肽肿瘤不会增加TC-1荷瘤小鼠的存活时间。结论与研究意义:1、Caerin多肽在体外具有杀伤肿瘤的作用且对正常转化细胞不造成损伤。2、Caerin多肽温敏性凝胶在体内外具有抗肿瘤的活性。3、Caerin多肽凝胶稳定性好,在常温存储1月和4℃保存5月仍具有生物活性。4、Caerin多肽温敏性凝胶作用于TC-1肿瘤体表时,具有抑制肿瘤生长、抗肿瘤的活性。对比5%Imiquimod Cream(艾达乐~?软膏)副作用更小,caerin多肽温敏性凝胶有可能成为治疗尖锐湿疣的选择药物。5、Caerin多肽温敏性凝胶抑制肿瘤生长的机制之一是招募更多T细胞和NK细胞浸润到肿瘤局部。6、Caerin多肽联合治疗性疫苗Ex/MPLA/α-IL10R免疫的抗肿瘤作用更强,可以延长荷瘤小鼠的生存周期和抑制肿瘤的生长,提高治疗性疫苗Ex/MPLA/α-IL10R对宫颈癌的治疗效果。研究意义:Caerin多肽温敏性凝胶的研发可以为尖锐湿疣的治疗提供更好的选择。Caerin多肽可以提高HPV治疗性疫苗疗效,为开发包括宫颈癌在内的多种HPV感染相关疾病的治疗性疫苗的研究奠定坚实基础。