论文部分内容阅读
近几十年来,2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）的患病率逐年上升,2019年全球约有4.17亿名T2DM患者,其中我国T2DM患者高达约1.04亿,这俨然成为了严重威胁人类健康和生活品质的问题。T2DM主要表现为胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）,即机体不能对胰岛素产生正常反应的状态。随着经济水平提高,居民膳食结构转变,能量摄入过量越来越多,其中高脂食物摄入量增加尤为显著。大量研究表明,高脂膳食（High fat diet,HFD）的过量摄入会诱发机体代谢组织产生胰岛素抵抗,从而导致血糖升高。近年来随着“饮食-肠道菌群-代谢”轴研究的逐步深入,肠道菌群紊乱被认为是HFD诱导IR的重要因素。目前,临床上使用的降糖药物普遍存在明显副作用等安全性问题。益生菌作为公认安全的直接调节肠道菌群类膳食补充剂,已经广泛应用于调控机体代谢和防治免疫相关疾病。植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）,是一类具有多样化的代谢通路和极强的环境适应能力的益生菌,目前被广泛应用于糖脂代谢、炎症和肠道疾病等相关健康领域。国内外研究证实,植物乳杆菌可改善HFD诱导的小鼠肥胖和肠道微生态紊乱,但高脂膳食条件下植物乳杆菌对胰岛素抵抗的影响还不明确。此外,大量文献报道植物乳杆菌发酵的果蔬能改善IR。蓝莓,已被证实具有缓解胰岛素抵抗的功效,但植物乳杆菌发酵蓝莓对胰岛素抵抗是否有显著增效尚未可知。据此,本研究首先通过体外实验从12株不同来源的植物乳杆菌中筛选出具有潜在降糖活性的菌株。然后,通过C57BL/6小鼠试验,基于高脂膳食诱导的IR模型,验证植物乳杆菌改善IR的功能,再利用肠道微生物组学和胆汁酸靶向代谢组学等技术,阐明活性菌株的作用机制。最后,以筛选得到的菌株发酵蓝莓,综合评价发酵蓝莓对胰岛素抵抗的影响,得到的主要研究结果如下:1.体外筛选实验结果表明,12株不同的植物乳杆菌表现出不同的基本益生特性（胃肠道耐受性和粘附特性）。N1和YJ14模拟胃肠液耐受性最强。YJ7的Caco-2细胞粘附性能最佳。YN8、N1、B2和YJ7的DPPH自由基清除能力较强,B2的羟自由基的清除能力最强。N1的发酵上清（Cell free supernatant,CFS）对α-葡萄糖苷酶抑制活性最强,YJ7的细胞提取物（Cell free extracts,CFE）对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最强。T17的CFS对正常Hep G2细胞摄糖促进作用最强,B2的CFE对正常Hep G2细胞摄糖促进作用最强。N1的CFS显著提高了胰岛素抵抗Hep G2细胞的摄糖量,在CFE中,B2、S4和YJ7显著提高了胰岛素抵抗Hep G2细胞的摄糖量。B2的CFS抑制胰岛素抵抗Hep G2细胞合成TG的能力最强。CFS中YJ7和YJ14提高了胰岛素抵抗Hep G2细胞HL酶活,YJ14的CFE增加了HL酶活。灭活的N1促进腹腔巨噬细胞和RAW264.7巨噬细胞分泌IL-10的能力最强。PCA分析和模糊综合评价分析发现,YJ7评分最高,并高于对照菌株鼠李糖乳杆菌GG（LGG）,这说明YJ7可能是潜在的改善胰岛素抵抗最强的菌株。2.益生菌（YJ7、N1和LGG）灌胃HFD喂养小鼠试验结果表明,摄入YJ7能显著降低HFD引起的脂肪组织和肝脏的脂质累积,并一定程度缓解HFD诱导的高水平LDLC。YJ7显著改善HFD诱导的IR,并调节糖稳态。此外,YJ7还改善了HFD诱导的低度炎症,调节了胆汁酸代谢,并显著提高了粪便中短链脂肪酸的含量。在3株供试菌中,YJ7对HFD诱导胰岛素抵抗的改善作用最为显著。3.肠道微生物组学和靶向代谢组学分析结果表明,YJ7对HFD饲喂小鼠的肠道菌群和胆汁酸代谢有显著调节作用。摄入YJ7增加了HFD小鼠肠道菌群的多样性。YJ7降低了HFD饲喂小鼠肠道中与肥胖和代谢紊乱正相关的肠道微生物Oscillibacter和Pseudoflavonifractor菌属的丰度,同时提高了与糖代谢紊乱负相关Saccharibacteria＿genera＿incertae＿sedis的丰度。本研究还发现植物乳杆菌可以定植于肠道中,Saccharibacteria＿genera＿incertae＿sedis spp和Flexistipes spp为响应YJ7调节作用的肠道菌。此外,YJ7明显上调了胆汁酸代谢相关菌的丰度,改变了HFD饲喂小鼠粪便胆汁酸的组成,激活肠道FXR-FGF15通路和TGR5通路,抑制糖异生PEPCK和G6PC基因的表达,从而改善HFD诱导的胰岛素抵抗。YJ7不能显著改善HFD饲喂小鼠的炎症和肠道屏障功能。因此,推测YJ7可能是通过调控“肠道菌群-胆汁酸”轴来改善HFD诱导的胰岛素抵抗。4.植物乳杆菌为主的益生菌组合制剂（自制菌剂）发酵蓝莓试验表明,自制菌剂对酸度、总糖、还原糖、有机酸的影响较大,对p H值和总酚的影响较小。与未发酵蓝莓（Blueberry juice,BBJ）和商业发酵菌制剂发酵蓝莓（Commercial starter fermented blueberry juice,CFBJ）相比,自制菌剂发酵蓝莓（Self-made starter fermented blueberry juice,FBJ）具有更高的抗氧化能力。FBJ对E.coli,S.aureus和S.Typhimurium的抑菌活性最强,且FBJ对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用也更强。此外,FBJ促进Hep G2细胞的葡萄糖摄取活性最强。5.以饲喂HFD的C57BL/6雄性小鼠为研究对象,并分别以自由摄水方式给予稀释10倍后的蓝莓果汁（BBJ、FBJ和CFBJ）干预17周。结果表明,3种蓝莓汁均可显著降低HFD饲喂小鼠的脂肪积累和LDL-C水平。与BBJ和CFBJ相比,FBJ具有相对更好的缓解HFD诱导的体重增加效果。FBJ组小鼠的体重增加百分比几乎与NCD组相同,比BBJ组和CFBJ组小鼠低约10%。所有蓝莓汁均显著改善了HFD诱导的高脂血症和胰岛素抵抗。FBJ显著上调了胰岛素信号转导通路中的关键蛋白（IR,IRS,AKT和GLUT-4）从而增加机体的胰岛素敏感性,显著下调脂质合成的关键蛋白（FAS,SREBP1c和SCD）从而减轻脂质累积。此外,BBJ、FBJ和CFBJ显著改善了HFD饲喂小鼠肠道菌群的丰富度和多样性,并改变了肠道菌群结构。与HFD组相比,FBJ组小鼠粪便中与肥胖正相关菌（Oscillibacter和Alistipes）的丰度显著下调,而与肥胖负相关菌（Akkermansia、Barnesiella、Olsenella、Bifidobacterium和Lactobacillus）的丰度显著上调。综上,益生菌发酵蓝莓可以显著缓解高脂膳食诱导的胰岛素抵抗,并调控肠道菌群稳态。