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糖尿病是继心血管疾病之后的第二大慢性疾病,其中2型糖尿病(Type 2diabetes mellitus,T2DM)占据90%-95%。糖尿病的高血糖毒性,异常胰岛素及细胞因子水平、氧化应激等,导致了以低骨量和骨组织微结构破坏为特征糖尿病性骨质疏松的形成。对于口腔种植而言,血糖控制较差的患者早期骨整合能力下降,周围软组织愈合时间延长,感染几率增加。近年来,干细胞的发现为各种组织修复带来了新的希望,干细胞具有多向分化、自我更新以及分泌多种细胞因子能力,可参与损伤组织与器官修复和再生。干细胞可分为全能干细胞,多能干细胞和单能干细胞,分化潜能逐级下降。组织工程技术利用干细胞来提高糖尿病患者的成骨能力,也得到多个实验证实。来源于自体的干细胞,由于临床易得、能促进长期的移植生存和移植耐受等优点,成为理想的种子细胞。其中,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)及脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells,ASCs)应用最为广泛。但考虑到临床应用中,BMSCs获取困难,同时糖尿病患者来源的BMSCs相比正常BMSCs数量减少,再生能力减弱,增殖和存活能力降低,成骨分化显著下降,限制了其在再生方向的应用。而T2DM来源的ASCs(ASCs-T2DM)获取简便,且获取数量并未减少,生长曲线和对照组类似,故而ASCs成为更具有应用前景的细胞。但是,T2DM个体来源的ASCs相比健康个体来源ASCs(ASCs-Control,ASCs-C)成骨能力减弱,应用于骨组织修复时不能满足需要,主要是因为2型糖尿病的机体环境可改变ASCs成骨及增殖能力。换而言之,对于单独糖尿病患者,其患病前后的不同的机体状态也会影响基因的表达,但个体本身的基因序列并未发生改变,而此种现象可能与表观遗传有关。DNA甲基化是表观遗传中研究最为广泛的部分,往往基因启动子区的DNA甲基化会抑制基因的表达。考虑到研究单独个体时建模前后的不稳定性,因此,我们选择研究T2DM来源的ASCs同健康大鼠来源ASCs在基因启动子区DNA甲基化水平的差异,寻找差异基因,以明确T2DM机体环境对ASCs成骨能力影响的具体机制。第一部分ASCs-T2DM与ASCs-C对比研究目的:建立T2DM大鼠模型,比较ASCs-T2DM及ASCs-C体外成骨及增殖能力。方法:高脂高糖饲料喂养结合小剂量STZ腹腔注射构建T2DM模型;建模成功后,利用酶消化法提取健康及2型糖尿病大鼠ASCs,培养至P3细胞待用;流式细胞术检测细胞表面分子的表达;克隆形成实验检测克隆形成能力;CCK-8方法检测细胞增殖能力;成骨成脂诱导验证多向分化能力;q-PCR检测成骨相关基因的表达,Western Blot检测成骨相关蛋白的表达。结果:成模后大鼠体重降低,血糖持续维持高于16.7mmol/L;流式检测显示两种细胞均阳性表达干细胞相关的表面标志物(CD29和CD90),不表达血细胞相关的表面标志物(CD34和CD45);相比ASCsC,ASCs-T2DM克隆形成能力以及增殖能力显著下降;成脂诱导后染色发现:两种干细胞经诱导均可产生脂滴;成骨诱导碱性磷酸酶(ALP)染色可见:ASCs-T2DM细胞ALP的表达量明显低于ASCs-C;茜素红染色显示:ASCs-T2DM形成的矿化结节较少;q-PCR及Western Blot结果表明,ASCs-T2DM成骨相关基因及相关蛋白表达也低于ASCs-C。结论:ASCs-T2DM增殖能力,克隆形成及成骨分化能力显著低于ASCs-C。第二部分ASCs-T2DM与ASCs-C全基因组DNA甲基化测序及差异基因的筛选目的:筛选ASCs-T2DM与ASCs-C中与成骨相关的启动子区DNA甲基化差异基因。方法:提取ASCs-T2DM与ASCs-C的DNA,做全基因组甲基化测序;选取与成骨相关,并且p值小于0.05的GO term,选出相关基因;结合DNA甲基化及q-PCR结果分析,筛选甲基化水平与基因表达水平成负相关的基因;结合IGV软件和文献阅读,确定目的基因。结果:全基因组甲基化结果显示,两者在DNA甲基化水平上确实存在差异。启动子区甲基化差异基因,共有253个。与成骨相关,并且p值小于0.05的GO term基因有:C3(补体C3,complement C3),Calca(降钙素基因相关肽,alcitonin-related polypeptide),Ereg(上皮调节蛋白,epiregulin),il20rb(白细胞介素20受体亚基,interleukin 20 receptor subunit beta);其中C3及Calca的表达水平与DNA甲基化水平呈负相关。最终确定差异最为显著基因:Calca。结论:ASCs-T2DM与ASCs-C在启动子区DNA甲基化水平上确实存在差异,其中Calca在ASCs-T2DM中的DNA甲基化水平高于ASCs-C,而其表达水平低于ASCs-C。第三部分CGRP促进ASCs-T2DM成骨分化的功能验证目的:探究体外药物CGRP对ASCs-T2DM的形态、增殖和成骨能力的影响。方法:配制含CGRP不同浓度(10-7mol/L,10-8 mol/L,10-9 mol/L,0 mol/L)的完全培养基及成骨诱导培养基,鬼笔环肽染色检测CGRP对细胞形态的影响;CCK-8检测CGRP对细胞增殖能力的影响;成骨诱导染色后检测不同浓度CGRP对ASCs-T2DM体外成骨能力的影响;q-PCR检测其对ASCs-T2DM成骨相关基因表达的影响。结果:不同浓度CGRP对细胞形态无明显影响;但其可影响糖尿病大鼠ASCs的增殖能力,其中10-7-10-8mmol/L浓度培养基可显著提升其增殖能力;ALP染色显示:在此因子的干预下,ALP的表达量显著升高,且呈浓度依赖;茜素红染色显示,CGRP能促进ASCs-T2DM中钙结节的形成,同样呈浓度依赖;q-PCR结果显示:在CGRP的干预下,成骨相关基因表达显著上升。结论:在一定范围内,Calca基因编码产物CGRP不影响ASCs-T2DM的细胞形态,但能提升其体外成骨分化和增殖能力。第四部分Calca基因DNA甲基化改变的位点及功能验证目的:反向验证ASCs-T2DM中Calca基因启动子区DNA目的片段的甲基化水平与基因表达的关系,并研究其具体机制。方法:用甲基化抑制剂5-氮胞苷对ASCsT2DM进行体外干预,鬼笔环肽染色检测5-氮胞苷对细胞形态的影响;亚硫酸氢盐扩增子测序检测5-氮胞苷对ASCs-T2DM目的片段DNA甲基化水平的影响;q-PCR检测5-氮胞苷干预后ASCs-T2DM中Calca及DNMT1的表达。结果:5-氮胞苷可显著改变ASCs细胞形态;测序结果表明:5-氮胞苷可降低的ASCs-T2DM中Calca基因启动子区目的片段DNA甲基化水平;q-PCR结果显示:5-氮胞苷干预后的ASCs-T2DM中Calca表达量上升,同时甲基化转移酶DNMT1表达量下降。结论:5-氮胞苷可降低ASCs-T2DM中Calca基因的启动子区目的片段DNA甲基化水平,此过程可能是通过降低DNMT1的表达来介导,进而提升Calca基因的表达。