研究背景和意义阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种起病隐匿的进行性发展的中枢神经系统退行性疾病,临床上主要表现为进行性记忆减退和认知障碍。AD可能是一组异质性疾病,病因尚未十分明确,存在多种因素,包括生物因素和社会心理因素。近年来大量研究证实,AD脑(尤其在海马)内持续存在着慢性进展性的炎性反应,认为小胶质细胞活化及炎症介导的神经毒性在神经退行性疾病的发病机制中起了决定性作用,炎性反应是AD出现认知和记忆障碍的重要机制。其中,有证据表明,p淀粉样蛋白(amyloid-beta, Aβ)沉积激活小胶质细胞引起的炎症反应是AD的发病核心,Aβ诱导引起的神经炎症是AD进展的关键事件之一,其中小胶质细胞是主要涉及的细胞,因此对小胶质细胞的激活进行干预可能会减缓疾病的进程,从而对中枢神经系统起保护作用,因而,以小胶质细胞为靶目标的研究有望成为新型抗AD药物研发的新方向。另外,目前公认的是胆碱能假说,认为老年认知障碍的临床症状是由于患者脑内胆碱酯能神经元损伤引起乙酰胆碱生成、释放减少所致。AD患者乙酰胆碱递质减少,因此,可通过增加乙酰胆碱的含量来治疗AD。目前有关AD抗炎方面药物的研究主要集中在诸如非类固醇抗炎药(NSAIDS)、雌激素等,其防治AD的共同通路可能都是通过抑制AD的始动环节,即抑制患者脑内Ap沉积和老年斑的形成以及由此而引发的脑内炎症反应。但NSAIDs的长期应用可导致严重的胃粘膜损伤和肾功能障碍等,长期使用雌激素可能诱发乳腺或子宫内膜的癌变；NSAIDs和雌激素的毒副作用,限制了它们在临床上的使用。葛根素(Puerarin)是从中药葛根中提取的异黄酮类化合物,具有阻断p受体、增加脑血流和脑代谢、清除氧自由基、促进免疫、改善学习记忆、抑制Ap激发的大鼠海马炎性反应等功效,是临床上治疗冠心病、脑血栓的常用和有效药物,但由于其脂溶性差,血脑屏障透过率低,因此在治疗脑部疾病时不能充分发挥其药理活性,很大程度上限制了其临床疗效的发挥。乙酰葛根素(六乙酰葛根素,化学名8-C-β-D-2",3”,4”,6”-四乙酰基吡喃葡萄糖-7,4’-二乙酰基异黄酮)是由葛根素经用醋酐溶解并酰化得到的葛根素衍生物,在大鼠体内代谢为葛根素,口服后在大鼠体内的暴露水平得到显著提高,更容易通过血脑屏障发挥作用,有更大的临床应用价值和前景。以往研究显示乙酰葛根素对脑缺血再灌注的保护作用,其机制可能通过作用于NMDA受体、抗氧自由基、抗脂质过氧化、抑制C-fos和ICAM-1、诱导VEGF等。但关于乙酰葛根素用于AD抗炎作用的研究文献报道较少。壳聚糖(Chitosan)是甲壳素脱乙酰化的产物,为天然阳离子聚合物,无毒,安全可靠,呈碱性,且具有很好的生物相容性。国外研究表明,壳聚糖能调节细胞分化、增殖及细胞因子的产生,清除自由基,中和体内毒素,保护脑神经细胞和神经胶质细胞膜。有研究发现,高分子量水溶性壳聚糖能预防神经细胞凋亡。Mi-Sun Kim等体外研究显示水溶性壳聚糖的抗炎作用,可降低并延迟AD病理改变。卵磷脂是生物细胞膜的主要构成成份,且具有抗炎、增强免疫作用,所含胆碱可作为神经递质乙酰胆碱的前体物质,是神经元之间依靠化学物质传递信息的一种最主要的“神经递质”,一旦与壳聚糖形成复合物,可作为载体携带壳聚糖通过血脑屏障。本课题组前期应用溶剂分散法和湿态研磨法制备壳聚糖磷脂复合物,并进行了其防治老年性痴呆的基础和临床研究,从组织形态学角度研究发现壳聚糖磷脂胆碱的抗氧化、保护神经细胞作用,显示壳聚糖磷脂胆碱可提高痴呆大鼠和老年性痴呆病人的记忆能力,修复痴呆大鼠的神经细胞膜损伤,增加脑乙酰胆碱含量,清除自由基,改善脑功能。但壳聚糖磷脂胆碱用于对AD的抗炎作用及机制研究,文献中尚未见报道。本研究分两部分：第一部分Aβ诱导AD大鼠的炎症机制及乙酰葛根素的干预作用第二部分壳聚糖磷脂酰胆碱对Aβ诱导AD大鼠的学习记忆作用及抗炎机制第一部分Ap诱导AD大鼠的炎症机制及乙酰葛根素的干预作用目的本研究采用体内实验,从整体、组织、细胞、分子水平,利用双侧海马注射Aβ1-42所致AD模型大鼠为研究对象,利用行为学、免疫组织化学、分子生物学等技术方法,观察乙酰葛根素对Aβ诱导大鼠学习记忆的作用及抗炎机制,为AD治疗提供有效的策略方法和理论依据。方法采用双侧海马注射Aβl-42法所致AD模型大鼠为研究对象。实验动物分组：将40只wistar大鼠随机分为空白对照组、Aβ模型组、乙酰葛根素低剂量组和高剂量组,每组各10只。术后14天,药物低剂量组和高剂量组分别腹腔注射给予乙酰葛根素100mg/kg和200mg/kg,共12天。对照组和模型组给予腹腔注射相同容量生理盐水,共12天。应用Morris水迷宫试验观察乙酰葛根素对Aβ1-42诱导模型大鼠的学习记忆功能,包括观察记录大鼠的逃逸时间及在原平台象限停留时间。应用免疫组织化学法、透射电镜技术,观察乙酰葛根素对Ap1.-42模型大鼠大脑皮层及海马小胶质细胞的影响。并应用免疫组织化学法检测海马PKC-δ、IKK-β、iNOS阳性表达及定位。应用Western-blot法检测Aβ1-42大鼠海马PKC-δ、IKK-β及IL-1β的蛋白质表达水平。应用ELISA法检测大鼠血清中IL-6含量的变化。全部数据分析均采用SPSS17.0软件进行。实验数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析及t检验,P<0.05为具有统计学意义。结果1.Aβ1-42诱导对大鼠学习记忆能力的影响及乙酰葛根素的作用Morris水迷宫定位航行实验显示,模型制备前,4组大鼠到达平台的逃避潜伏期大致相同(P>0.05)；术后14天,模型组、药物低剂量组、高剂量组大鼠到达平台的潜伏期明显长于空白对照组(P<0.01)；术后26天,即乙酰葛根素治疗12天后,空白组、药物低剂量、高剂量组大鼠到达平台的潜伏期明显短于模型组(乙酰葛根素低剂量组,P<0.05；乙酰葛根素高剂量组,P<0.01)。空间探索实验显示：模型制备前,4组大鼠在原平台象限停留时间大致相同(P>0.05)；术后14天,模型组、药物低剂量组、高剂量组大鼠在原平台象限停留时间减少,明显少于空白对照组(P<0.01)；乙酰葛根素治疗12天后,空白对照组、药物低剂量组、高剂量组大鼠在原平台象限停留时间明显高于模型组(乙酰葛根素低剂量组,P<0.05；乙酰葛根素高剂量组,P<0.01)。2.Aβ1-42诱导对大鼠大脑皮层及海马小胶质细胞的影响及乙酰葛根素的作用大脑皮层Ibal免疫组织化学染色结果：模型组小胶质细胞(Microglia,MG)数目最多,胞体增大增粗,黄染,着色深；乙酰葛根素低剂量组、高剂量组MG数目较少,胞体变小,淡染,着色浅；对照组MG数目最少,淡染。Ibal阳性细胞计数结果显示,模型组与对照组比较,MG数目明显增多(P<0.05),而乙酰葛根素低剂量组和高剂量组与模型组比较,前额皮层小胶质细胞数目明显减少(乙酰葛根素低剂量组,P<0.05；乙酰葛根素高剂量组,P<0.01)。透射电镜结果显示：对照组MG较小,可见清晰的粗面内质网和线粒体,核仁清楚,异染色质明显,电子密度高。模型组MG有较多突起,异染色质减少和松散,胞浆丰富,核糖体数量增加,并可见溶酶体颗粒。乙酰葛根素低剂量组：胞浆电子密度低,可见破碎的线粒体嵴。乙酰葛根素高剂量组：细胞核形状规则,可见高尔基复合体。3.Aβ1-42诱导对大鼠海马组织中PKC-δ及IKK-β的影响及乙酰葛根素的作用PKC-δ、IKK-β被选为本研究与NF-κB通路相关的指标。免疫组织化学法检测了每组大鼠海马组织PKC-δ和IKK-β的免疫染色反应。PKC-δ染色结果：其免疫反应阳性物质呈棕黄色,定位于胞膜和胞浆。AD模型组PKC-δ的免疫反应阳性细胞最多,着色最深,细胞内的阳性颗粒最多,主要位于胞浆内；对照组和药物组阳性细胞较少,神经元胞浆着色浅。定量分析结果显示：模型PKC-δ海马阳性细胞的数量高于对照组、乙酰葛根素低剂量组和乙酰葛根素高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性。在IKK-β免疫反应染色也观察到了类似的结果：模型组海马区IKK-β阳性细胞最多并成深棕色；对照组IKK-β阳性细胞较少,基本没有棕黄色颗粒表达的IKK-β,偶见神经元胞浆浅着色；乙酰葛根素组可见到少量IKK-β免疫反应阳性细胞且着色浅。定量分析结果显示：模型IKK-β海马阳性细胞的数量高于对照组、乙酰葛根素低剂量组和乙酰葛根素高剂量组,差异有统计学意义,(P<0.05),并呈剂量依赖性。Western blot法观测了大鼠海马组织PKC-δ和IKK-β的表达,结果显示：双侧海马注射Aβ1-42能显著增加PKC-δ和IKK-β的表达,模型组约为正常对照组的2倍。乙酰葛根素治疗能显著减低Aβ1-42引起PKC-δ和IKK-β的表达,并呈剂量依赖性。4.Ap1-42诱导对大鼠海马组织中iNOS、IL-1β及血清IL-6的影响及乙酰葛根素的作用iNOS、IL-1β及IL-6被选为本研究炎症反应的标志物。免疫组织化学法检测了海马组织iNOS的表达。iNOS染色结果：其免疫反应阳性物质呈棕黄色,定位于细胞的胞膜和胞浆。其中,AD模型组iNOS的免疫反应阳性细胞最多,着色最深,细胞内的阳性颗粒最多,主要位于胞浆内；对照组和药物组阳性细胞较少,神经元胞浆着色浅。定量分析结果显示：模型iNOS海马阳性细胞的数量高于对照组、乙酰葛根素低剂量组和乙酰葛根素高剂量组,差异有统计学意义(乙酰葛根素低剂量组P<0.05；乙酰葛根素高剂量组P<0.01),并呈剂量依赖性。Western blot分析表明,双侧海马注射Aβ1-42能显著增加IL-1p的表达,模型组约为正常对照组的2倍。Elisa实验结果显示,治疗后模型组血清中IL-6的含量显著高于空白对照组、乙酰葛根素低剂量组、高剂量组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.Ap1-42双侧海马注射能明显降低大鼠学习记忆能力,成功模拟炎性AD模型,可以用于检测药物的抗炎作用。2.乙酰葛根素对Aβ1-42所致AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显的改善作用；由此推断出,乙酰葛根素能够成为防治AD发生发展的新型药物。3.乙酰葛根素的作用机制可能是抑制了Ap沉积所引起的小胶质细胞激活,下调脑组织PKC-δ和IKK-β的表达,从而抑制NF-κB信号通路的激活,减少了炎性因子iNOS、IL-1β、 IL-6的分泌,减轻大脑皮层、海马神经元及小胶质细胞的炎性反应,从而发挥其神经保护作用。第二部分壳聚糖磷脂酰胆碱对Aβ诱导AD大鼠的学习记忆作用及抗炎机制目的本研究采用体内实验,从整体、组织水平,利用双侧海马注射Aβ25-35所致AD模型大鼠为研究对象,应用行为学、免疫组织化学技术观察壳聚糖磷脂酰胆碱对Ap诱导大鼠的作用及抗炎机制,为AD治疗提供有效的策略方法。方法采用喷雾干燥器制备壳聚糖磷脂酰胆碱复合物微球,用分光光度法分别测定壳聚糖、卵磷脂的含量。采用双侧海马注射Aβ25-35法所致AD模型大鼠为研究对象。实验动物分组：将50只Wistar大鼠随机分为对照组、Aβ模型组、壳聚糖磷脂酰胆碱低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组各10只。术后第7天开始,壳聚糖磷脂酰胆碱低剂量组、中剂量组、高剂量组分别给予0.2/(k·d)、0.4/(kg·d)和1.0/(kg·d)灌胃,共30天。对照组和模型组给予相当剂量生理盐水灌胃,共30天。应用Morris水迷宫试验,观察壳聚糖磷脂酰胆碱对Aβ25-35诱导模型大鼠的学习记忆功能,包括观察记录大鼠的逃逸时间、穿越平台次数及在原平台象限停留时间。应用免疫组织化学技术,观察壳聚糖磷脂酰胆碱对Aβ25-35AD模型大鼠大脑皮层小胶质细胞的影响,并应用免疫组织化学法检测海马PKC-δ、iNOS及IL-1β的阳性表达及定位。全部数据分析均采用SPSS17.0软件进行。实验数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析及t检验,P<0.05为具有统计学意义。结果1.壳聚糖磷脂酰胆碱对AD模型大鼠学习记忆能力的影响AD动物模型制备前,各组大鼠学习记忆水平比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。造模14d后,模型组和壳聚糖磷脂酰胆碱组大鼠的学习记忆水平明显低于对照组(P<0.01)。药物干预30d后,各壳聚糖磷脂酰胆碱组及对照组大鼠平均潜伏期(average escape latency, AEL)明显缩短,且单位时间内跨越原平台次数及在原平台象限停留时间增加,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。2.A β25-35诱导对大鼠大脑皮层MC的影响及壳聚糖磷脂酰胆碱的作用大脑皮层Ibal免疫组织化学染色结果：模型组MG数目多,胞体增大增粗,黄染,着色深；壳聚糖磷脂酰胆碱低剂量组、中剂量组、高剂量组MG数目减少,胞体变小,淡染,着色浅；对照组MG数目最少,淡染。定量分析结果显示：模型组Ibal反应强度明显高于正常组(P<0.05),壳聚糖磷脂酰胆碱低剂量组、中剂量组、高剂量组阳性表达依然强于正常组,但明显弱于模型组P<0.05)。3.壳聚糖磷脂酰胆碱对Aβ25-35诱导Wistar大鼠海马PKC-δ的影响PKC-δ在大鼠海马区的免疫反应程度,依次为模型组、壳聚糖磷脂酰胆碱低剂量组、中剂量组、高剂量组、对照组。PKC-δ免疫反应阳性物质呈棕黄色,定位于细胞的胞膜和胞浆。其中,模型组PKC-δ阳性细胞最多并着色深,细胞内的阳性颗粒最多,主要位于胞浆内；对照组PKC-δ阳性细胞最少,偶见神经元胞浆浅着色。定量分析结果显示：模型PKC-δ海马阳性细胞的数量高于对照组、壳聚糖磷脂酰胆碱低剂量组、中剂量组、高剂量组,差异有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性。4.壳聚糖磷脂酰胆碱对Aβ25-35诱导Wistar大鼠海马iNOS、IL-1β的影响Ap模型组iNOS和IL-1β阳性细胞表达明显高于对照组,壳聚糖磷脂酰胆碱低剂量组、中剂量组、高剂量组。壳聚糖磷脂酰胆碱药物组和模型组相比,炎性因子iNOS和IL-1p的阳性细胞数显著下降,差异有统计学意义(P<0.01),壳聚糖磷脂酰胆碱药物组和对照组相比,阳性细胞表达数差异无统计学意义(P>0.05)。提示Aβ25-35诱导可激发大鼠海马组织iNOS和IL-1p的表达,而壳聚糖磷脂酰胆碱可降低iNOS和IL-1β的表达。结论1.以壳聚糖和大豆卵磷脂为原料经喷雾干燥法可以合成壳聚糖磷脂酰胆碱复合物微球。这一方面提高壳聚糖的脂溶性,使壳聚糖更有效地发挥作用；另一方面可以更好地发挥卵磷脂供给胆碱及保护神经元细胞膜的作用。2.壳聚糖磷脂酰胆碱对Aβ25-35所致AD模型大鼠的学习记忆障碍有明显的改善作用；3.壳聚糖磷脂酰胆碱可能是通过抑制小胶质细胞增生及激活,进而减少细胞因子iNOS、IL-1β的产生,从而发挥其神经保护作用。4.壳聚糖磷脂酰胆碱可能是通过下调脑组织PKC-δ的表达,进而抑制NF-kB通路激活,从而降低炎性因子的分泌。