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第一部分:人脐带间充质干细胞培养上清液对甲状腺乳头状癌细胞诱导人脐静脉内皮细胞血管形成的影响目的:探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)培养上清液对甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)细胞系TPC-1诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)血管形成的作用。方法:1.采用成脂、成骨诱导实验以及流式细胞术分析干细胞表面分子标志鉴定间充质干细胞。2.使用不同浓度的hUCMSCs培养上清液(hUCMSC culture supernatant,hUCMSC-CS)刺激甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1。3.基质胶小管形成实验检测经hUCMSC-CS作用后的TPC-1细胞对HUVEC血管形成的影响。4.CCK-8法检测hUCMSC-CS对TPC-1细胞增殖能力的影响。5.实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附实验(ELISA)分别检测经hUCMSC-CS作用后的TPC-1细胞中血管内皮生长因子(VEGF)m RNA和蛋白的表达及其培养上清液中VEGF的浓度。结果:1.hUCMSCs具有向骨、脂肪等组织分化的能力,细胞表面CD73和CD90阳性率大于95%,而CD14和CD19阳性率小于2%。这些结果符合国际细胞治疗学会对MSC的定义,提示hUCMSCs提取的成功。2.与对照组相比,hUCMSC-CS可显著抑制TPC-1细胞的增殖(P<0.05);经hUCMSC-CS刺激后的TPC-1细胞,其诱导HUVEC血管形成能力显著下调(P<0.001),且TPC-1细胞中VEGF的m RNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.001),其培养上清液中VEGF浓度显著降低(P<0.05)。结论:hUCMSC-CS可显著下调TPC-1细胞中VEGF的表达及分泌,抑制TPC-1细胞诱导HUVEC血管形成的能力。第二部分:人脐带间充质干细胞胞外囊泡对甲状腺乳头状癌细胞的作用目的:探讨人脐带间充质干细胞胞外囊泡(hUCMSC-EVs)对甲状腺乳头状癌细胞的作用。方法:1.采用超高速离心法从人脐带间充质干细胞培养上清液中分离提纯胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)。采用透射电子显微镜观察hUCMSC-EVs的形态;蛋白质印迹检测hUCMSC-EVs的表面标志分子;激光共聚焦实验检测PTC细胞摄取内化hUCMSC-EVs。2.使用不同浓度的hUCMSC-EVs刺激PTC细胞。3.CCK-8实验及Ed U增殖实验检测hUCMSC-EVs对PTC细胞的增殖能力的影响;流式细胞术检测hUCMSC-EVs对PTC细胞凋亡的影响。4.采用Transwell法来检测hUCMSC-EVs对PTC细胞迁移与侵袭能力的影响。5.建立裸鼠荷瘤模型,给予hUCMSC-EVs瘤内注射治疗,并观察在体内hUCMSC-EVs对肿瘤生长的影响。6.蛋白质印迹印迹以及免疫组织化学法检测经hUCMSC-EVs处理过的PTC细胞及裸鼠肿瘤组织中相关蛋白表达水平的变化。结果:1.成功分离提纯得到hUCMSC-EVs,其直径在55-450 nm范围,集中于142nm;表达EVs特征性标志CD63,不表达细胞内质网标志Calreticulin;透射电镜下观察hUCMSC-EVs成典型的“杯状”样囊泡结构;且hUCMSC-EVs可被PTC细胞摄取内化。2.与对照组相比,hUCMSC-EVs可显著抑制PTC细胞的增殖能力(P<0.05),促进其凋亡(P<0.001);并且抑制PTC细胞中Erk信号通路的活化,下调PTC细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调促凋亡蛋白Bax的表达。3.与对照组相比,hUCMSC-EVs可显著抑制PTC细胞的迁移与侵袭的能力(P<0.001);并且上调PTC细胞中E-cadherin的表达,下调Vimentin的表达。3.与对照组相比,hUCMSC-EVs可显著抑制裸鼠体内瘤体的生长(P<0.001);瘤体切片中有更低的Ki-67阳性细胞;瘤体组织中E-cadherin蛋白的表达上调,而Vimentin蛋白表达下调。结论:hUCMSC-EVs可显著抑制PTC细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进其凋亡;并且hUCMSC-EVs在裸鼠体内可抑制肿瘤的生长。这些结果提示hUCMSC-EVs可抑制PTC的进展。