研究背景　　阿尔兹海默病(Alzheimers disease，AD)是一种进行性神经系统退行性病变，其主要的病理学改变为β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积及过度磷酸化tau蛋白引起的神经元纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs）。AD的临床症状包括认知功能障碍（记忆力下降为一突出表现），社会生活能力下降，言语功能障碍，人格改变等。通过AD的发病年龄可将其分为早发型阿尔兹海默病和晚发型阿尔兹海默病。目前认为65岁前发病的为早发型阿尔兹海默病，该类型多为家族遗传性病变，患者往往具有与AD发病呈正性相关的突变基因，但此类型在所有AD中所占比例较少。晚发型阿尔兹海默病是AD的主要类型，患者多于65岁以后发病。随着人口老龄化程度的不断加剧，AD的发病率不断上升，且随着病情的不断进展，AD患者会逐渐失去生活自理能力，这给家庭及社会带来了巨大的负担。目前，药物治疗是临床上AD的唯一治疗方法，其主要原理为增加脑内兴奋性递质，但该方法也仅限于延缓病情进展，并不能阻止病情的进展和逆转相关症状。因此，研究开发对AD的新型治疗途径是很有必要的。目前关于AD的发病机制有多种学说，包括:Aβ沉积学说、tau蛋白异常磷酸化毒性学说等。有学者提出由于在人的老龄化过程中所受到的氧化应激不断积累及各种体内外稳态失衡引起的系统性炎性反应和脑内炎症反应及其诱发的体内免疫反应可能是AD起病及病情进行性加重的重要因素。脐血多能干细胞(Cord-blood stem cells,CB-SCs)是一种较为新型的多能干细胞，具有免疫调节作用，可调节淋巴细胞的功能及分型，且不具有技术和伦理限制。本研究将与CB-SCs共培养的淋巴细胞通过尾静脉注射移植入阿尔兹海默病小鼠体内，对其作用及效果进行初步观察。　　研究方法　　1.脐血多能干细胞的制备　　采集健康产妇的脐带血，将其加入含有单核细胞分离液的离心管中，采用密度梯度离心法分离出单个核细胞，然后加入红细胞裂解液裂解红细胞。分离出的细胞种植于Petri培养皿中培养。　　2.淋巴细胞制备　　无菌条件下分离出阿尔兹海默病模型小鼠的脾脏，研磨，制备出细胞悬液，将其加入淋巴细胞分离液，分离出淋巴细胞，根据实验要求将淋巴细胞与脐血多能干细胞共培养或是单独进行培养。　　3.阿尔兹海默病小鼠的处理　　将与CB-SCs共培养或单独培养的淋巴细胞通过尾静脉注入阿尔兹海默病小鼠体内，每月1次，连续注射4个月。　　4.行为学测定　　末次注射结束2周后，进行Morris水迷宫实验观察小鼠的空间学习及记忆能力。　　5.外周血血浆与淋巴细胞标本采集　　行为学实验完成后，乙醚麻醉小鼠，内眦静脉采集小鼠外周血，4℃条件下离心，分离出血浆，冻存。重悬细胞沉淀，将其加入淋巴细胞分离液中，分离出淋巴细胞。　　6.流式细胞学检测　　向培养的淋巴细胞及分离出的小鼠外周血淋巴细胞加入相应流式抗体:anti-Mouse APC-conjugated CD4, anti-Mouse PE-conjugated CD25,4℃条件下避光孵育30min，固定破膜后加入anti-Mouse PE-Cy7-conjungated Foxp3抗体，4℃条件下避光孵育30min，检测调节性T淋巴细胞所占比例。　　7.ELISA　　每组取3只小鼠进行心脏灌流，于冰上快速取脑，分离海马与皮层，液氮冻存。称取皮层组织0.1g，加入900uL PBS制成10％的脑组织匀浆，于4℃离心机中4000r/min，离心20min，取上清，用ELISA试剂盒检测上清及血浆中的TNF-α，TGF-β1，IL-10，IL-1β炎性因子含量。　　8.免疫荧光染色　　每组取3只小鼠进行心脏灌流固定，取脑后于4％多聚甲醛中在4℃条件下过夜后固定，30％蔗糖过夜脱水后制作15um冰冻切片。进行免疫荧光染色。　　9.PCR检测脑组织内炎性因子含量　　通过逆转录和实时定量PCR检测脑组织内炎性因子基因表达。使用Qiagen试剂盒提取小鼠脑组织内总mRNA，根据TAKALA反转录试剂盒说明书将单链RNA反转为cDNA。以AB17300HT Fast Real-Time PCR system进行实时定量PCR检测，以GAPDH作为内参。　　10.TUNEL染色　　根据TUNEL试剂盒说明书进行操作，对小鼠脑组织切片进行染色，染色结束后于普通荧光显微镜下观察。　　研究结果　　1.静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞组阿尔兹海默病小鼠表现出空间学习及记忆能力的改善　　通过对小鼠进行Morris水迷宫实验发现，静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞组AD小鼠（实验组）其空间探索时间较注射单独培养淋巴细胞组AD小鼠（对照组）下降明显。且实验组小鼠穿过目的象限的次数(6.667±0.88)及在目的象限的探索时间（17.6±2.111 s）均大于对照组的穿越平台次数(3.667士0.33)和目的象限探索时间（11.77士1.185 s）(P＜0.05)。　　2.通过流式细胞学检测发现静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞的阿尔兹海默病小鼠外周血淋巴细胞中调节性T细胞(Tregs)含量升高　　流式细胞学检测发现与CB-SCs共培养的淋巴细胞及实验组小鼠外周血淋巴细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞即调节性T细胞(Tregs)比例高于对照组(P＜0.05)。　　3.ELISA检测发现静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞可调节阿尔兹海默病小鼠外周及脑内的炎性反应　　通过ELISA检测发现实验组小鼠外周血血浆中的促炎因子TNF-α(P＜0.001)和IL-1β(P＜0.01)含量较对照组明显降低，而其血浆中的抗炎因子IL-10(P＜0.05)和TGF-β1(P＜0.01)含量高于对照组。实验组脑组织匀浆中的TNF-α含量高于对照组(P＜0.001)，而IL-10，IL-1β浓度差趋势虽与血浆相同，但无统计学意义。　　4.免疫荧光染色发现静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞实验组小鼠脑内Aβ沉积量降低，而iba-1+的小胶质细胞数目升高　　通过脑组织切片的免疫荧光染色发现实验组小鼠脑组织内Aβ沉积量低于对照组(P＜0.05)，而iba-1+小胶质细胞数量大于对照组(P＜0.05)。且在融合图像中发现实验组中iba-1+小胶质细胞更倾向于围绕在Aβ沉积斑块周围。　　5.实时定量PCR发现静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞可起到调节实验组小鼠脑内炎性因子mRNA表达量作用　　通过实时定量PCR检测小鼠脑组织内促炎因子(TNF-α，IL-1β)及抗炎因子(IL-10，TGF-β1)的mRNA表达量，发现实验组小鼠脑组织内TNF-α，IL-1β的mRNA表达量低于对照组，而IL-10，TGF-β1表达量高于对照组。(P＜0.05)　　6.TUNEL一步法检测发现尾静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞可改善小鼠脑内神经元凋亡情况　　通过TUNEL检测发现在实验组小鼠脑皮层和海马中的凋亡神经元比对照组明显减少。(P＜0.01)　　结论　　1.静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞可调节阿尔兹海默病模型小鼠外周及脑内的免疫炎性反应。　　2.静脉注射与CB-SCs共培养的淋巴细胞可通过调节阿尔兹海默病模型小鼠外周及脑内的免疫炎性反应而进一步改善该病的病理改变及所引起的认知功能障碍。