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目的:慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病。其特点是存在能够编码具有较强酪氨酸激酶活性蛋白的Ph染色体以及Bcr-Abl融合基因。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)作为其靶向药物,疗效显著。但是随着疾病的进展以及治疗期的延长,另一严峻问题逐渐显现——TKIs耐药。骨髓微环境(Bone Marrow Micro-environment)是造血干细胞生长发育的主要场所,与肿瘤的发生、进展及耐药有着密不可分的联系。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)作为骨髓肿瘤微环境(tumor micro-environment)中的最重要的基质细胞之一,在这过程中扮演重要角色。因此,我们在体内外条件下研究CML患者来源骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)对慢性髓细胞白血病细胞株K562增殖能力、凋亡水平及对伊马替尼(Imatinib,IM)敏感性的影响,以初步探讨BM-MSCs影响慢性粒细胞白血病进展及耐药的机制,为缓解、甚至逆转CML对IM耐药提供实验基础。方法:收集CML患者骨髓标本,利用密度梯度离心法结合贴壁分离筛选法提取BM-MSCs,并通过H-E染色进行形态学鉴定,通过传代纯化细胞。将BM-MSCs与K562细胞以不同比例接触共培养,绘制K562细胞生长曲线,并利用流式细胞术检测K562细胞凋亡水平及所处细胞周期。将BM-MSCs与K562细胞种植于BALB/C裸鼠右侧腋窝皮下,观察裸鼠皮下瘤成瘤情况,绘制生长曲线。皮下瘤形成2周后每日灌胃给药IM,4周后处死裸鼠,计算体积抑瘤率。应用H-E染色及TUNEL染色实验检测肿瘤凋亡情况,计算坏死评分和凋亡指数。利用免疫荧光技术及Western Blot检测皮下瘤内生存、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及IL-7R/Jak/Stat5信号通路相关蛋白IL-7R、Jak-1、Jak-3、Stat5、p Jak-1、p Jak-3、p Stat5的表达水平。结果:1.细胞形态学显示:首次分离获得的人BM-MSCs细胞体积大,胞浆与胞核的比例高,呈纺锤形、多角形或椭圆形,有长短不齐的突起。贴壁生长,相互间独立,部分呈漩涡状、辐射状分布,形成成纤维样细胞集落。随着代数增加BM-MSCs得到纯化。2-3代后BM-MSCs具有典型的MSCs形态特征,呈较均一长梭形,核浆比例大,细胞间紧密贴附,呈鱼群状分布。2.BM-MSC抑制K562细胞增殖:(1)在体外环境下,与BM-MSCs共培养后,K562细胞生长速度减慢。(2)在体内环境下,相比K562细胞组皮下瘤,K562+BM-MSCs组皮下瘤终体积、终重量减小(2.63±0.06 vs.1.97±0.04,P<0.05)。3.BM-MSCs抑制K562细胞凋亡:(1)在体外环境下,将K562细胞与BM-MSCs分别以100:1、10:1、5:1、1:1的比例共培养48h。流式结果显示,加入BM-MSCs后K562细胞凋亡减少。并且随着BM-MSCs浓度的增加,凋亡水平逐渐降低。(2)在体内环境下,相比K562细胞组,K562细胞+BM-MSCs组皮下瘤凋亡、坏死程度减轻(凋亡指数8.98±0.06%vs.5.08±0.01%,坏死评分2.25±0.25 vs.1.5±0.33,P<0.05)。免疫荧光及Western blot结果也提示K562细胞+BM-MSCs组皮下瘤凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达量增加、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达量降低(P<0.05)。4.BM-MSCs阻滞K562细胞于G0/G1期:在体外环境下,将K562细胞与BM-MSCs分别以100:1、10:1、5:1、1:1的比例共培养48h。流式结果显示,随着BM-MSCs比例的升高,处于G0/G1期的K562细胞逐渐增多。5.BM-MSCs降低K562细胞对IM的敏感性:相比K562细胞+IM组,K562细胞+BM-MSCs+IM组皮下瘤终重量减轻(1.57±0.02g vs.1.17±0.06g,P<0.05),抑瘤率降低(53.76±0.01%vs.13.20±1.90%,P<0.05),坏死程度增加(坏死评分0.25±0.25 vs.1.25±0.25,凋亡指数0.09±0.02%vs.2.39±0.07%,P<0.05)。免疫荧光及Western blot结果提示,相比K562细胞+IM组,K562细胞+BM-MSCs+IM组皮下瘤内凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。6.IL-7R/Jak/Stat5信号通路与BM-MSCs降低K562细胞对IM敏感性过程具有相关性:免疫荧光及Western blot结果显示,相比K562细胞+IM组,K562细胞+BM-MSCs+IM组皮下瘤内IL-7R、Jak-1、Jak-3、Stat5、p Jak-1、p Jak-3、p Stat5蛋白水平升高(P<0.05)。结论:1.CML患者来源BM-MSCs可以降低CML细胞凋亡、增殖水平,使细胞长期处于静息状态,增加其生存能力。2.CML患者来源BM-MSCs降低CML细胞对IM的敏感性。3.L-7R/Jak/Stat5信号通路有可能参与介导了BM-MSCs降低CML细胞对IM敏感性的过程。