背景HIV感染溯源研究对于了解HIV的传播和进化规律、开展HIV职业暴露感染鉴定、医源性感染调查和司法调查等具有重要价值。国外文献报道的实验室方法主要有PCR产物直接测序、巢式PCR产物克隆测序、终点有限稀释PCR产物测序,用于在HIV基因亚型或准种水平上推断HIV的传播关系甚至传播方向。但这些方法要么所获得的信息量小、要么操作繁琐。本课题组赵琦等将Miseq高通量测序(以下简称Miseq测序)成功地用于一起疑似经性传播HIV的感染溯源调查,通过提取血浆中RNA、反转录、巢式PCR扩增后进行Miseq测序,可以推断HIV的传播关系和传播方向,提供了一种操作较简便、成本较低、实用价值较高的HIV感染溯源调查技术。本研究对前期建立的HIV Miseq测序分析技术进行了优化,选择传播关系和传播时间明确的7对婚内传播HIV夫妻作为研究对象,研究异性传播HIV的准种传播和进化规律。目的1、研究异性传播HIV的准种群传播规律。2、探讨样本类型(全血、血浆)及抗病毒治疗对结果分析的潜在影响。3、探讨婚内性传播HIV感染者的个体内及夫妻间HIV准种随感染时间的进化规律。材料和方法1、研究对象(1)选择传播关系明确、传播时间在1.5年以内的7对婚内性传播HIV夫妻(其中6对夫妻传播时间在半年以内)作为研究对象,编号为F1/M1～F7/M7。流行病学调查显示：7对夫妻中的先感染者通过非婚异性性接触(6人)或注射毒品(1人)感染HIV,之后分别传染了其配偶。其中,6对夫妻的婚内性传播方向为男传女、1对为女传男。14名研究对象中除F3、F5、M5、F7、M7已进行0.5～57个月的抗病毒治疗(Antiretroviral Th(rapy, ART)外,大部分未治疗过。采集7对夫妻的血液样本,于-80℃保存全血、血浆样本各14份。(2)对1对夫妻(F1、M1)进行连续随访采样,采样时间间隔为3-23个月。其中F1随访采样至感染后54个月,分别收集9个时间点的血浆样本9份、全血样本7份,共计16份；M1随访采样至感染后37个月(他在感染后第42个月死亡),分别收集6个时间点的血浆样本6份、全血样本5份,共计11份。2、实验方法(1)从血浆样本中提取RNA,从全血样本中提取总核酸；(2)对RNA产物进行逆转录,合成cDNA；(3)对cDNA、总核酸进行巢式PCR扩增目的片段(用于基因亚型分析及Miseq测序的目的片段不同,引物不同)；(4)琼脂糖凝胶电泳及紫外成像检测；(5)PCR产物直接测序及基因亚型分析；(6) Miseq测序：对前期方法进行优化,主要包括：①单样本建库代替混合样本建库；②采用PE300程序代替PE250。测序后对准种序列进行系统进化树分析。结果1、7对夫妻的分析结果(1)HIV基因亚型：每对夫妻的HIV基因亚型都分别相同,F1和M1、F3和M3同为HIV-101BC亚型,F4和M4同为HIV-1 CRF07_BC亚型,F5和M5同为HIV-1 CRF08_BC亚型,F2和M2、F6和M6、F7和M7同为HIV-1 CRF01_AE亚型。基因亚型分析结果支持婚内性传播的流行病学调查结果。(2)HIV准种群分布：在28份样本中,24份扩增成功并进行Miseq测序。其中所有全血样本均扩增成功,第3对、第5对夫妻共4人的血浆样本扩增失败。分析频数50及以上的准种群序列,血浆样本获得的有效序列数为83290-209120(平均154176)条,代表29～455(平均139)个准种群,每份样本中,频数最高的准种群占所有序列总频数的比例为10.0%-98.9%(平均51.4%)；全血样本获得的有效序列数为67831-193202(平均134219)条,代表12～284(平均97)个准种群,每份样本中,频数最高的准种群占所有序列总频数的比例为25.2%～99.2%(平均75.0%)。血浆、全血样本获得的有效序列数和准种群数均无显著性差异(p>0.05),全血样本中频数最高的准种群占总序列的比例明显高于血浆样本(p<0.05)。20/24的样本中频数最高(最优势)的前20个准种群序列的频数之和占HIV准种群所有序列总频数的比例都超过了80%,只有1份(M2P)较低(约45%),另外3份样本达到70%(M6P、M6W、M7P)。9/14的研究对象(F1、 F2、F3、M3、F4、M4、F5、M5、M7)全血样本中第1个优势序列频数占了85%以上。(3)基因离散率变化范围：各研究对象的样本内基因离散率为0.6%-4.4%(血浆样本)或0.5%-4.0%(全血样本),血浆、全血样本所得的样本内基因离散率之间差异无统计学意义(P>0.05)。夫妻间HIV的平均基因离散率为0.7%-5.1%(血浆样本)或0.5%～6.8%(全血样本)。(4)系统进化树分析：每对夫妻的HIV准种序列分别单独聚集在一簇,伴有较高的bootstrap值(大于90),结合基因离散率,提示夫妻间存在传播关系,并排除实验交叉污染的可能性。系统进化树可以显示样本间的并系关系进而推断传播方向,除了第1对夫妻单独分析血浆样本以外,其他样本在单独分析血浆、全血样本或混合分析2类样本时,均得到正确的传播方向。夫妻2人感染时间的间隔越长,序列区分越清楚,如第2对夫妻感染时间相差8年以上,HIV序列各自聚集；而第1对夫妻感染时间接近(窗口期传播),2人的多数序列互相交集。(5)样本类型及抗病毒治疗对结果分析的潜在影响：血浆样本扩增的是RNA中的目的片段,10/14份样本扩增成功；全血样本扩增的是前病毒DNA中的目的片段,全部扩增成功。二者获得的准种群序列数量相当。判断传播方向时,4/5对夫妻的血浆样本及7/7对夫妻的全血样本可以准确判定。抗病毒治疗的5个研究对象中,血浆样本只有2人扩增成功,而全血样本全部扩增成功；全血、血浆样本的Miseq测序结果都可以正确判断传播关系及传播方向。第7对夫妻中的先感染者已进行抗病毒治疗57个月,也同样能识别传播关系及传播方向。2、第1对夫妻随访样本的分析结果(1)HIV准种群分布：在后感染者F1的16份样本中,血浆样本8份Miseq测序成功,1份失败；全血样本7份全部Miseq测序成功。先感染者Ml的11份样本中,血浆、全血样本全部扩增成功。F1获得的有效序列数如下：血浆样本为83290～180118(平均131094)条,全血样本为83329～175811(平均122444)条,分别代表23～322(平均125)个、12～190(平均67)个准种群。M1获得的有效序列数如下：血浆样本为69949～172087(平均114462)条,全血样本为75115～259369(平均166507)条,分别代表41～311(平均145)个、22～188(平均98)个准种群。F1、M1血浆的准种分布有随时间逐渐分散的趋势,全血的准种群分布变化规律不如血浆明显。(2)基因离散率：随访样本中的HIV准种群的基因离散率随着时间的推移均有逐渐增大的趋势,从感染后1月到37月,Fl样本内的平均基因离散率从0.7%(血浆)、0.6%(全血)增加到2.3%(血浆)、3.1%(全血),M1样本内的平均基因离散率从0.6%(血浆)、0.8%(全血)增加到0.7%(血浆)、2.7%(全血)。针对每个受检者,不同时间随访采样与第1次采样之间的基因离散率也有不断增加的趋势,F1在感染后3月及37月时,样本与第1次采样(感染后1月)之间的平均基因离散率从0.9%(血浆)、0.6%(全血)增加到2.5%(血浆)、3.4%(全血),M1在感染后3月及37月时,样本与第1次采样(感染后1月)之间的平均基因离散率从0.8%(血浆)、0.7%(全血)增加到4.1%(血浆)、3.2%(全血)。随着时间的推进,夫妻间的基因离散率不断增加,从感染后1月到37月,夫妻间的平均基因离散率从0.7%(血浆)、0.7%(全血)增加到5.4%(血浆)、4.7%(全血)。(3)系统进化树分析：感染早期,各样本的准种群序列分布较为集中,样本之间的准种群序列分布也很接近,但随着感染时间的推移,样本内的准种群序列分布逐渐分散,各样本之间的准种群分布也逐渐远离。除了感染后12月的系统进化树判定传播方向错误,其他样本在单独分析血浆、全血样本或混合分析2类样本时,均得到正确的传播方向。结论1、通过对7对婚内性传播HIV夫妻感染者的准种传播情况进行分析,Miseq测序结果支持传播关系及传播方向的流行病学调查结果；抗病毒治疗未影响传播关系及传播方向的判定。2、HIV准种群的多样性和频数分布有助于了解HIV的传播和进化规律,全血样本所得的HIV感染溯源分析结果比血浆样本更可靠、更实用。3、随着时间的推进,不同时间随访采样与第1次采样之间的基因离散率不断增加,夫妻间的基因离散率也不断增加。参照国外报道,感染后3年时,随访采样与第1次采样之间的基因离散率可达到3%,传染源与感染者之间的基因离散率可达到5%左右。4、对于传播方向的判定,要考虑多种因素：(1)采样距感染时间；时间越短,越容易判定,具体到多少年有待进一步研究；(2)2个感染者的感染时间间隔；间隔越长越容易判定,窗口期传播在判定传播方向时要特别慎重,尤其是采样距传播时间较长时。