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帕金森病是和年龄相关的神经退行性疾病,其特征是黑质多巴胺能神经元的特异性退行病变。一些神经毒剂如6-羟多巴胺(6-OHDA)可以在一些试验模型中模拟这一病理过程。研究表明,神经细胞内铁平衡紊乱和氧化应激与PD的病理过程密切相关。细胞质铁蛋白可以截获储存铁,因而可以保护细胞免受潜在的铁诱导的自由基损伤。线粒体铁蛋白(mitochondrial ferritin, MtFt)是2001年发现的一个定位在线粒体上的蛋白质,和细胞质铁蛋白的H链(H-ferritin)有很高的同源性,而且它们的亚铁氧化酶中心的氨基酸序列相当保守。其功能还不明了。最近的免疫组化研究结果表明,MtFt可以特异的在脑的皮质和脊髓神经细胞内表达,而这些区域是耗氧较多、代谢活性较高的区域。以前的研究表明,过表达MtFt可以造成细胞内铁的重新分布,导致细胞内铁缺乏,使得癌细胞对叔丁基过氧化氢造成的氧化损伤的敏感性增加。为了研究MtFt在6-OHDA诱导的PD细胞模型中的作用,我们在人的多巴胺能神经元SH-SY5Y中过表达鼠的MtFt,建立了MtFt-SY5Y和P10-3-SY5Y(空质粒对照)细胞系。实验中我们选择了6-OHDA诱导的SH-SY5Y、MtFt-SY5Y和P10-3-SY5Y细胞作为细胞模型,运用了MTT、流式细胞术、荧光显微成相,细胞免疫荧光和蛋白质杂交等方法研究了氧化应激状态下MtFt-SY5Y细胞的凋亡特性。结果如下:(1)成功的将MtFt基因转入到神经细胞SH-SY5Y中,建立了MtFt-SY5Y和P10-3-SY5Y细胞系,发现过表达MtFt可以显著的抑制细胞的生长,这可能是由于胞质内铁缺失造成的。(2) MtFt的表达抑制了由6-OHDA造成的细胞内活性氧(reactive oxygen species ROS)、钙离子和脂质过氧化水平的增加,细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的下降。与对照组相比,这些指标差异显著(p<0.01)。(3)一个有趣的现象是,MtFt的表达上调了诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase iNOS)的表达,造成细胞内NO浓度显著升高。与野生型SH-SY5Y或转空质粒P10-3-SY5Y细胞相比,NO增加了两倍多,差异极其显著(p<0.01)。(4) MtFt的表达保护了线粒体复合物I的酶活性,经6-OHDA处理的P10-3-SY5Y细胞与对照组相比,其线粒体复合物I的酶活力下降了约70%,而经6-OHDA处理的MtFt-SY5Y细胞,其线粒体复合物I的酶活力仅降低了约20%,统计结果表明,其差异极其显著(p<0.01)。(5)应用细胞免疫荧光技术和Western blot均证明了MtFt的表达抑制了细胞色素C的释放。(6) MtFt的表达显著的抑制了由6-OHDA诱导的LIP的升高,经6-OHDA处理的P10-3-SY5Y细胞,其胞内的LIP与对照组相比增加了150%,而MtFt-SY5Y细胞经相同条件处理后,于对照组相比,其LIP仅增加了约50%,统计结果显示,差异显著(p<0.01)。(7)核染色技术和流式细胞分析技术都证明了MtFt的表达抑制了由6-OHDA引起的细胞凋亡。SH-SY5Y和P10-3-SY5Y细胞经药物处理后凋亡率分别为70%和67%左右,而MtFt-SY5Y的凋亡率仅为10左右%,统计结果显示,其差异极其显著(p<0.01)。(8) Wester blot研究发现, MtFt的表达降低了Bax的表达,对于MtFt-SY5Y细胞,Bcl-2、ferritin、TfR和NF-kB的表达水平无论是用药物处理还是不用药物处理都没有显著变化。相反,对于P10-3-SY5Y细胞,这些检测指标都发生了显著变化。结论:本论文首次将MtFt转染到神经细胞SH-SY5Y中,在6-OHDA诱导的PD细胞模型上,研究了MtFt在氧化应激状态下的功能以及铁代谢和PD的关系。本研究结果首次证明,MtFt在保护神经细胞线粒体免受由6-OHDA诱导引起的氧化损伤中具有重要的保护作用。其机制可能是通过调节铁的代谢,抑制Fenton反应,从而减少活性氧和过氧亚硝基的生成,降低脂质过氧化水平,防止线粒体膜电位崩溃,保持细胞内钙离子平衡,阻止LIP的增加和细胞色素C的释放,抑制凋亡信号通路上促凋亡蛋白的表达,维持抗凋亡蛋白的表达等多途径而起到对细胞的保护作用的。尽管MtFt上调了iNOS的表达,增加了细胞内NO的水平,但是由于ROS的产生减少,所以ROS和NO反应产生的过氧亚硝基也会减少,从而阻抑了由6-OHDA诱导的通过ROS/NO途径对细胞引起的凋亡信号通路,而起到对细胞的保护作用。调节MtFt在神经细胞中的表达可以十分有效的防止PD的发生,显著的阻抑由神经毒素引起的神经细胞凋亡,起到神经保护的作用。本研究结果对于人们深入了解PD的致病机理和今后的有效治疗都具有重要的意义。由于MtFt属于内源性蛋白,所以它的表达不会对机体产生副作用,因此深入了解并掌握MtFt的调控机制应当成为今后工作的重点,我们的工作对于PD的治疗和预防提供了一种新的有效策略。