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目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种典型的自身免疫性疾病，其病变特征包括患者血清中出现高水平的针对自身核抗原产生的自身抗体。目前SLE的发病机制仍未完全明确，与多种因素有关。正常情况下，哺乳动物DNA等核成分的免疫原性很弱，难以诱导自身抗体产生，因而阐明自身DNA如何打破免疫耐受激活免疫系统是研究SLE发病机制的重点。 我们实验室前期研究发现与正常淋巴细胞来源的DNA(UnALD-DNA)相比，用ConA活化的淋巴细胞来源的DNA(ALD-DNA)免疫同系BALB/c小鼠可以诱导抗dsDNA抗体的产生，高水平尿蛋白等SLE样综合征的发生;进一步研究发现:ALD-DNA可以有效活化免疫细胞，尤其是巨噬细胞，分泌大量炎性细胞因子，其中巨噬细胞是参与天然免疫的重要细胞，同时也是一类专职APC，在天然免疫应答和适应性免疫应答过程中均发挥着重要作用。但是ALD-DNA是如何被巨噬细胞识别，进而活化巨噬细胞的，其具体机制还有待进一步研究。 高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是高迁移率族蛋白(HMG)家族成员之一，因在聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中迁移率高而得名。它广泛存在于真核细胞内，能够调节基因转录、稳定核小体的结构以及释放后具有炎症介质功能的核蛋白，是一种重要的与损伤相关的分子识别模式(damageassociated molecular patterns，DAMPs)。静息条件下，HMGB1存在于细胞核内，当机体受到一定刺激时，核内的HMGB1可通过活化的免疫细胞如巨噬细胞或单核细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放转移至细胞外。研究发现，HMGB1能够结合多种核酸成分，进而活化下游特异性核酸受体，诱导巨噬细胞分泌大量炎性因子，在机体免疫系统对核酸成分应答的过程中可能扮演着重要角色。近年来有研究显示HMGB1可以激活和趋化炎症细胞，诱导大量细胞因子的分泌，被认为是一种新型的炎性介质，正引起国内外学者的广泛关注。 前期我们实验室研究发现HMGB1在ALD-DNA诱导巨噬细胞活化中扮演一定的角色，但是HMGB1是如何增强巨噬细胞对ALD-DNA的识别，加重炎症反应，并且胞浆还是分泌到胞外的HMGB1对ALD-DNA识别、摄取及细胞内的运输等影响是怎样的尚不清楚。在本研究中，我们重点探讨了胞外还是胞内的HMGB1在ALD-DNA诱导巨噬细胞活化中的作用机制，即HMGB1介导ALD-DNA刺激巨噬细胞活化的形式、位置及其机制。这一研究不仅有助于我们更好地解释HMGB1促进ALD-DNA诱导巨噬细胞活化的机制，而且为阐明SLE的发病机理提供了更坚实的理论依据，有利于为SLE的防治策略寻找到新的靶点。 方法:首先用ALD-DNA刺激RAW264.7巨噬细胞系后，用Western blot和ELISA的方法检测细胞以及上清中HMGB1的表达情况。含有HMGB1-shRNA的慢病毒载体经293 T细胞包装病毒后，感染RAW264.7，Real-time和Western blot评估HMGB1下调效率。ALD-DNA刺激上述HMGB1稳定下调的巨噬细胞(HMGB1KD RAW264.7)及正常RAW264.7，流式细胞术检测细胞表面协同刺激分子表达水平，Real-time检测细胞内IL-6，IL-10，TNF-α mRNA表达情况，以评估HMGB1在ALD-DNA诱导巨噬细胞活化中的作用。用丙酮酸乙酯抑制HMGB1分泌出细胞外，HMGB1拮抗剂A盒肽和HMGB1特异性中和抗体等处理细胞后，ELISA和Real-time的方法检测炎性细胞因子的表达情况，同时我们给予正常RAW264.7和HMGB1KD RAW264.7细胞外源HMGB1蛋白时，检测了炎性细胞因子的表达情况，以评估胞外HMGB1在ALD-DNA刺激巨噬细胞活化中的作用。最后我们探讨了HMGB1介导ALD-DNA诱导巨噬细胞活化的机制，首先用间接竞争性ELISA的方法HMGB1与ALD-DNA或UnALD-DNA的相互作用及结合亲和力的差异;随后通过流式细胞术检测了HMGB1对巨噬细胞吞噬ALD-DNA或UnALD-DNA的影响;最后用激光共聚焦荧光显微镜观测了HMGB1对ALD-DNA或UnALD-DNA进入细胞后囊泡运输间的影响。 结果:ALD-DNA可以有效刺激巨噬细胞活化，HMGB1分泌显著增加，并且呈现时间剂量依赖性;HMGB1-shRNA特异性下调HMGB1效果明显，下调效率达到1/5，可以用于后续实验;当巨噬细胞中HMGB1下调后，其分泌HMGB1的能力减弱，同时ALD-DNA诱导巨噬细胞表面协同刺激分子、MHC-Ⅱ类分子表达下降，炎性细胞因子mRNA表达显著减少，巨噬细胞活化程度降低。丙酮酸乙酯阻止巨噬细胞受ALD-DNA刺激后HMGB1的分泌，HMGB1在胞质中大量积累，细胞上清中炎性细胞因子的含量显著减少;HMGB1拮抗剂A盒肽和HMGB1特异性中和抗体处理细胞后，发现ALD-DNA刺激巨噬细胞分泌的炎性细胞因子含量也显著降低;同时给予正常RAW264.7以及HMGB1KD RAW264.7外源HMGB1蛋白时发现HMGB1可以增强ALD-DNA刺激正常RAW264.7分泌更多的炎性细胞因子，并且ALD-DNA刺激HMGB1KD RAW264.7分泌炎性细胞因子的能力在加入外源HMGB1后得到一定程度的恢复。竞争性间接ELISA的结果表明HMGB1可以与ALD-DNA和UnALD-DNA结合，但是与ALD-DNA的结合亲和力显著高于UnALD-DNA;HMGB1对巨噬细胞摄取不同DNA没有显著影响;激光共聚焦的结果显示HMGB1可以显著增加ALD-DNA在内体上的定位，并且加速了ALD-DNA在内体上的募集。 结论:ALD-DNA可以有效刺激巨噬细胞分泌HMGB1，并且这一过程具有时间剂量依赖性。HMGB1在ALD-DNA诱导巨噬细胞活化中具有重要作用，且胞外HMGB1在其中扮演关键角色。HMGB1可以有效与ALD-DNA结合，加速和增加了其在巨噬细胞内早期内体上的募集，从而促进了ALD-DNA诱导巨噬细胞活化，介导SLE的病理发展。该研究进一步阐明HMGB1介导ALD-DNA诱导巨噬细胞活化介导SLE发生的可能机制，对于深入理解SLE的发病机理和SLE临床治疗新策略都具有重要意义。