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[目的]分离脂肪来源干细胞(ADSCs)后进行培养并鉴定;利用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)来修饰壳聚糖(CS)、透明质酸(HA)制备具有生物活性CS-HA-IGF-1C水凝胶,评价其对ADSCs体外增殖及体内存活的生物学特性影响;建立糖尿病动物模型后行下肢缺血手术;将预处理后的干细胞移植入缺血性下肢,评价CS-HA-IGF-1C能否通过增强ADSCs的旁分泌作用改善其在体内存活能力,从而促进血管生成,改善血液灌注和肌肉再生,降低断肢率,同时探讨这种生物材料增强细胞治疗效果的机制,为使用组织工程学手段临床治疗糖尿病合并下肢缺血疾病提供新的理论依据。[方法]1.从8周龄健康BALB/c雄性小鼠的脂肪组织中分离出ADSCs进行体外培养并进行鉴定。2.通过CS-HA-IGF-1C水凝胶体外培养ADSCs,评价该水凝胶生物相容性。利用水凝胶培养ADSCs的条件培养基进行内皮细胞迁移和成管试验,观察该水凝胶对ADSCs旁分泌水平的影响。3.评价移植细胞的存活与驻留:利用AIE纳米粒子标记ADSCs后与水凝胶三维共培养,BALB/c雄性裸鼠21只建立下肢缺血模型,分为3组(每组7只),包括ADSCs组(下肢缺血+肌肉注射100 μL生理盐水的106ADSCs),ADSCs/CS-HA组(下肢缺血+肌肉注射 100 μL CS-HA 水凝胶的 106ADSCs),ADSCs/CS-HA-IGF-1C 组(下肢缺血+肌肉注射100 μL CS-HA-IGF-1C水凝胶的106 ADSCs)。所有小鼠分别在不同治疗后0天、1天,4天、7天、14天和21天,使用CRi Maestro E X动物成像系统进行荧光活体成像动态监测移植的ADSCs体内滞留状态。4.建立糖尿病下肢缺血动物模型:BALB/c雄性小鼠70只,腹腔注射小剂量(1%,50 mg/kg)链尿菌素(STZ),通过检测小鼠尾尖血糖水平确定1型糖尿病动物模型的成模情况。1型糖尿病小鼠成模后4周行结扎股动静脉手术,构建糖尿病下肢缺血动物模型。根据动物接受不同治疗类型将所有动物分为7组(每组10只),包括:Sham组(假手术组,糖尿病小鼠成模后4周单纯进行下肢血管探查),S aline组(糖尿病小鼠成模后4周+下肢缺血+肌肉注射100μL生理盐水),CS-H A组(糖尿病小鼠成模后4周+下肢缺血+肌肉注射100μL CS-HA水凝胶),CS-HA-IGF-1C组(糖尿病小鼠成模后4周+下肢缺血+肌肉注射100μL CS-HA-IGF-1C水凝胶),ADSCs组(糖尿病小鼠成模后4周+下肢缺血+肌肉注射100μL生理盐水的106ADSCs),ADSCs/CS-HA组(糖尿病小鼠成模后4周+下肢缺血+肌肉注射 100μL CS-HA 水凝胶的 106ADSCs),ADSCs/CS-HA-IGF-1C 组(糖尿病小鼠成模后4周+下肢缺血+肌肉注射100μLCS-HA-IGF-1C水凝胶的106 A DSCs)。上述细胞治疗组是ADSCs与水凝胶的三维培养后,分别用生理盐水、C S-HA水凝胶液体或CS-HA-IGF-1C水凝胶液体混匀细胞(106ADSCs/100 μL)。使用胰岛素注射器吸取注射入损伤肌肉,检测指标:细胞治疗后0天,7天和21天,利用多普勒血流仪监测小鼠手术下肢的血液灌流,PeriCam Psupporting系统分析获取平均血液灌流率值;损伤后早期(7天)评价各组ADSCs促进血管新生情况,肌肉内细胞增殖凋亡及炎症细胞浸润水平;损伤后晚期(21天)评价肌肉组织纤维化和促血管新生因子表达情况。[结果]1.体外培养的ADSCs具有较强的增殖能力。2.体外实验中干细胞与水凝胶材料三维培养后,发现CS-HA-IGF-1C水凝胶能够促进细胞增殖,促进ADSCs的迁移和成管。3.将AIE标记的ADSCs移植到缺血的下肢中,发现CS-HA-IGF-1C水凝胶预处理后的ADSCs在体内驻留率和存活率增加。4.利用血流多普勒观测小鼠损伤下肢血液灌流状况,发现利用CS-HA-IGF-1C 水凝胶联合ADSCs移植后显著促进了小鼠下肢缺血后的血流恢复,损伤后早期能够促进肌肉细胞增殖、减少炎症细胞浸润和细胞凋亡,促进血管新生;损伤后晚期能够显著减少肌肉内胶原沉积,并明显抑制肌肉纤维化,从而促进缺血下肢组织学和功能学修复,最终提高受损下肢的保肢率。[结论]1.在1型糖尿病(T1DM)模型基础上,4周后行下肢缺血手术,这种方法构建的DM下肢缺血动物模型可操作性强,成功率高,建模后稳定性可;2.体外实验中CS-HA-IGF-1C水凝胶可提高ADSCs增殖,增强ADSCs的旁分泌功能,具有良好的生物相容性;3.CS-HA-IGF-1C水凝胶可以显著改善ADSCs在体内的存活与驻留;4.CS-HA-IGF-1C水凝胶预处理ADSCs后注射到缺血部位,可修复缺血下肢,提高保肢率。