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目的:体外实验主要研究MENK通过调控阿片受体亚基对CD8~+ T细胞功能的影响。体内实验主要研究MENK对C57BL/6荷瘤小鼠脾中CD8~+ T细胞转录组的影响,以及对lncRNA及mRNA的差异基因表达的影响,并对差异表达基因进行富集分析,找出MENK调控CD8~+ T细胞的信号通路。研究方法:1.体外实验采用阴性富集法分离纯化C57BL/6小鼠脾脏CD8~+ T细胞,在RNA和蛋白水平分别采用real-time PCR和western blot检测MENK对CD8~+ T细胞的MOR和DOR表达的影响。在MENK的作用剂量上我们选择了0、10~-77 M、10~-88 M、10~-99 M、10~-1010 M、10~-1111 M。为了阻断μ受体的表达,我们选择了μ受体选择性阻断剂CTAP进行后续实验,分别采用0、4.5μM、450 nM、45 nM、4.5 nM对活化的CD8~+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了阻断δ受体的表达,我们采用δ受体选择性阻断剂NTI进行后续实验,分别采用0、10μM、1μM、100 nM、10 nM对活化的CD8~+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了同时阻断μ和δ受体,我们选择了非选择性阿片受体拮抗剂NTX体外阻断CD8~+ T细胞的阿片受体表达,分别采用0、13μM、1.3μM、130 nM、13 nM对活化的CD8~+ T细胞加药培养48 h,之后分别采用real-time PCR和western blot对MOR和DOR的RNA和蛋白表达水平进行检测。为了研究不同阿片受体对CD8~+ T细胞表型和功能的影响,我们采用流式细胞术对CD8~+ T细胞表面的CD28、PD-1、CTLA-4、FasL和胞内的GrzB、Prf进行了检测。为了研究MENK对CD8~+ T细胞增殖的影响,我们采用阴性富集法对细胞进行分离纯化,进行CFSE染色后加入CD3、CD28抗体激活刺激,药物分组为对照组、MENK组、CTAP+MENK组、NTI+MENK组、NTX+MENK组,各组均加药培养3天,然后采用流式细胞术检测细胞的增殖。2.采用C57BL/6 S180肉瘤荷瘤小鼠模型研究MENK体内对S180肉瘤的抗肿瘤作用及脾中CD8~+ T细胞转录组的影响。采用磁珠分选法阴性富集MENK治疗组及对照组小鼠脾中的CD8~+ T细胞,采用高通量RNA转录组测序分析MENK对纯化后各组中CD8~+ T细胞lncRNA及mRNA的影响。采用Cuffdiff软件对拼接后的转录本进行差异表达分析,使用基于负二项分布的模型,筛选条件为P-adjust<0.05。采用GOseq R包对差异表达基因的mRNA和lncRNA靶基因进行GO(基因本体)富集分析,筛选条件为校正后的P value小于0.05具有统计学差异,GO显著富集。采用KOBAS软件对本次测序中预测的差异表达mRNA和lncRNA进行KEGG信号通路富集。为了进一步验证差异表达基因,我们选择KEGG中富集的具有显著性差异的信号通路进行real-time PCR实验验证,主要验证的靶基因为cell cycle(P=0.005)通路中的CCnd3、Cdc7、Anapc4、Smc3、Atm;P53 pathway(P=0.007)中的Pten、Atr、Casp8、Ccnd3、Atm;Ras pathway(P=0.028)中的Rasgrp2、Pak2、Bad、Ets-1、Rap1b、Rala、Tbk1、Rasa3;Neurotrophin signaling pathway(P=0.005)中的Kidins220、Rap1b、Matk、Prkcd、Camk2b、Bad、Rps6ka3;经典阿片受体MOR、DOR。主要验证的差异表达lncRNA为GM27008、Snhg6、Tug1和Pvt1。结果:1.MENK在体外可以促进CD8~+ T细胞中阿片受体的表达,在RNA水平上,MENK可以促进MOR和DOR的表达,最佳的作用浓度是10~-1010 M,在此作用浓度相对于对照组MOR的表达量为2.03±0.21,DOR的相对表达量为1.89±0.45,差异有统计学意义(P<0.05)。CTAP处理后能够显著下调MOR的RNA和蛋白表达水平,各实验浓度的相对蛋白表达量依次为1.13±0.02、0.62±0.01、0.85±0.01、0.62±0.05、0.63±0.01,差异有统计学意义(P<0.05)。在RNA水平NTI能够显著抑制DOR的表达,同时上调MOR的表达(P<0.01)。在1μM作用下,DOR的相对表达显著下调,其对应的相对表达量为0.75±0.04,而MOR的相对表达出现上调,其对应的相对表达量为2.88±0.37,差异有统计学意义(P<0.01)。蛋白的实验结果与RNA水平相互验证,在1μM作用下,DOR的蛋白表达显著下调,蛋白条带相对于内参的相对表达量为0.56±0.02,MOR的蛋白条带相对于内参的表达量为1.09±0.05。在RNA水平NTX能够同时显著抑制MOR和DOR的表达,在1.3μM浓度作用时,MOR相对于β-actin的表达量为0.28±0.01,DOR相对于β-actin的表达量为0.35±0.03(P<0.01)。在蛋白水平表达结果与RNA水平趋势一致,在1.3μM浓度作用时,MOR相对于β-actin的表达量为0.44±0.02,DOR相对于β-actin的表达量为0.51±0.03(P<0.01)。MENK处理组CD8~+ T细胞表面的CD28、PD-1、CTLA-4、FasL和胞内的GrzB表达显著上升(P<0.01),选择性阻断MOR(CTAP+MENK)或DOR(NTI+MENK)后上述指标表达水平显著下降,而同时阻断MOR和DOR(NTX+MENK)后CD28、PD-1、CTLA-4、Fas L和GrzB的表达水平进一步下降。MENK处理组可显著增强CD8~+ T细胞的增殖(P<0.01);单纯阻断MOR(CTAP+MENK)或DOR(NTI+MENK)后不能阻断MENK对CD8~+ T细胞的增殖作用,同时阻断MOR和DOR后,MENK对CD8~+ T细胞的增殖作用消失。2.MENK治疗对S180肉瘤具有显著的抗肿瘤作用。对实验组和对照组脾中CD8~+ T细胞进行转录组测序后,基于转录组拼接结果,经过严格筛选,共预测得到845个不具有编码潜能的lncRNA。我们对差异表达的lncRNA、TUCP及mRNA进行了后续的聚类分析和GO及KEGG富集分析。MENK组相对于对照组差异表达的lncRNA有8个上调基因,5个下调基因;差异表达的TUCP有3个上调基因,7个下调基因;差异表达的mRNA有301个上调基因,240个下调基因。差异lncRNA靶基因GO富集分析结果主要为GO:0005251(delayed rectifier potassium channel activity),GO:0008076(voltage-gated potassium channel complex),GO:0034705(potassium channel complex),GO:0005249(voltage-gated potassium channel activity),GO:0034702(ion channel complex),GO:0043269(regulation of ion transport);差异mRNA GO富集分析结果主要为GO:0005634(nucleus),GO:0044260(Cellular macromolecule metabolic process),GO:0044428(nuclear part),GO:0005622(intracellular),GO:0031981(nuclear lumen),GO:0044237(Cellular metabolic process)。差异表达lncRNA靶基因KEGG富集分析结果主要为Thyroid cancer(Mmu05216),Cholinergic synapse(Mmu04725),Bladder cancer(Mmu05219),Fox O signaling pathway(Mmu04068),Endometrial cancer(Mmu05213),Acute myeloid leukemia(Mmu05221);差异表达mRNA靶基因KEGG富集分析结果为Ribosome(Mmu03010),Viral carcinogenesis(Mmu05203),Amphetamine addiction(Mmu05031),P53 signaling pathway(Mmu04115),Neurotrophin signaling pathway(Mmu04722),Alzheimer’s disease(Mmu05010)。通过Real-time PCR对预测的差异表达基因进行实验验证,证实具有统计学意义的差异表达mRNA为bcl-2、Bax、Rap1b、Pak2、Rasa3、Bad、Pten、Rasgrp2、MOR、DOR,其中表达上调的mRNA为:bcl-2、Pak2、MOR、DOR,表达下调的mRNA为:Bax、Rap1b、Rasa3、Bad、Pten、Rasgrp2;差异表达的lncRNA为GM27008和Pvt1,并且经过实验验证GM27008和Pvt1的RNA相对表达均为显著上调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.MENK通过上调μ和δ阿片受体调控CD8~+ T细胞的增殖和功能表型;MENK对CD8~+ T细胞的调控作用可以在μ或δ单独或同时被阻断时消失;MNEK可能通过调控阿片受体的联合亚基发挥重要的免疫调节功能。2.MENK对S180肉瘤具有显著的抗肿瘤效果;MENK治疗可提高荷瘤鼠脾和淋巴结中CD8~+ T细胞的比例。MENK治疗能够显著影响荷瘤鼠脾中CD8~+ T细胞转录组中mRNA及lncRNA的表达。