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背景: 婴幼儿血管瘤(Infantile hemangioma,IH)是一种以血管内皮细胞(hemangioma endothelial cell,HemEC)异常过度增殖为主要病理特征的血管性良性肿瘤.新生儿的发病率达4%-5%,早产儿发病率可高达23%.可累及全身各部位,如皮肤、肌肉、骨骼、心脏、肝脏等,约60%发生于头颈部,25%发生于躯干,15%发生于四肢.血管瘤在早期快速增生,形成无明确血管结构的内皮细胞团块,而后部分皮损缓慢自行消退,遗留纤维脂肪组织. 关于IH的发病机制,目前主要有遗传和基因突变学说、胎盘绒毛膜细胞异位学说、干细胞学说、局部缺氧学说,但没有一个学说能够全面的解释IH的病因、发病机制和临床特征.因此探索婴幼儿血管瘤的发病机制对于IH的防治具有重要的作用. 病理学研究显示,增生期血管瘤有大量内皮细胞构成,那么大量增生的内皮细胞从何而来?目前大多数观点认为增生期内皮细胞来源于血管瘤干细胞和内皮祖细胞,内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)是一类具有胚胎期成血管细胞特性,能增殖分化为成熟内皮细胞的前体细胞,目前认为CD34和CD133共同标记的细胞即为EPCs.近年研究显示EPCs有三大来源:骨髓、外周血和脐带血,而在早期血管瘤组织中无管腔样结构形成,外周血EPCs无法顺利进入胎儿组织,且骨髓源性EPCs数量多,分布广泛,这与血管瘤发病率和临床特征不相吻合,那么婴幼儿血管瘤增生期的内皮祖细胞是否来自于胎盘绒毛膜组织,其分化过程又受哪些因子的调控,这是课题组进行本项研究的意义所在. 课题组前期研究发现,在婴幼儿皮肤血管瘤快速增生期血管内皮生长因子(VEGF)和Delta样配体4(DLL4)高表达,且两者具有相关性.有研究发现548例曾行绒毛膜取材术的孕妇,其所生子女的婴幼儿血管瘤的发病率高达21.1%.所患血管瘤多数位于头部、颈部和胸部,而且多为多发性.绒毛膜绒毛取材术广泛应用于产前诊断,在此过程中可能导致胎儿暴露绒毛,导致相关并发症,如肢体缺陷、血管瘤和其他血管缺陷,尤其是在妊娠早期(8-9周),相应风险会更大.因此本课题猜想,在妊娠期间,由于行绒毛膜穿刺术、胎盘破裂或者胎盘组织部分梗死等因素导致胎盘组织EPCs随血液进入胎儿体内,在某部位定植,同时由于在围生期尤其是在胎儿娩出过程中,脐带绕颈及产道损伤导致胎儿、新生儿缺氧,促进缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)大量生成,从而增强VEGF基因的表达.这些因子的过表达进一步招募、刺激血管内皮祖细胞的增殖并分化为内皮细胞,形成大量的新生毛细血管,构成增生期血管瘤组织.而在消退期,EPCs数量大大减少,同时周细胞在周围血管刺激作用下大量增殖并进一步分化为脂肪细胞,构成消退期血管瘤组织主要细胞成分. 目的: 1.采用免疫组织化学染色法对增生期、消退期婴幼儿血管瘤和正常皮肤组织中VEGF/DLL4的表达量进行检测,分析二者之间的相关性,证实VEGF/DLL4调控增生期血管瘤血管的生成,从而调控血管瘤的发生. 2.通过免疫组织化学法SP法、免疫荧光法检测婴幼儿血管瘤组织中CD133、CD34、CD31蛋白的表达,证实增生期婴幼儿血管瘤组织中存在EPCs,且EPCs是血管瘤发生的的细胞学基础. 3.采用免疫组织化学法和免疫荧光法检测罹患婴幼儿血管瘤患儿的母体胎盘组织中CD133和CD34,证实胎盘组织中存在EPCs. 4.采用酶解法联合密度梯度离心法分离、培养胎盘绒毛膜组织细胞,采用免疫荧光染色法和流式细胞分选法鉴定在罹患婴幼儿血管瘤患儿的胎盘组织中存在内皮祖细胞,且其是婴幼儿血管瘤发生的细胞学基础;并对其行形态学观察,探索内皮祖细胞最优分离培养方法. 方法: 第一部分:收集婴幼儿血管瘤标本50例,其中新鲜标本5例,复习资料后将所有病例分为增生期组(n=26),消退期组(n=24),另取5例瘤旁正常组织作为对照.所有蜡块行HE染色,详细观察各阶段血管瘤病理特征.免疫组织化学染色,使用HPIAS-10高清晰彩色病理图文报告管理系统检测VEGF/DLL4蛋白的表达的平均光密度和阳性面积率并进行定量分析. 第二部分:⑴收集IH组织存档蜡块,整理患儿病历资料,确认所有患儿在外科手术前均未行任何辅助治疗,共计50例,其中男性22例,女性28例,年龄1月-2岁,平均1.3岁.所有血管瘤标本依据组织学特点,经过三位病理医师独立诊断加以确认.免疫组织化学染色和免疫荧光染色,使用HPIAS-10高清晰彩色病理图文报告管理系统检测CD133、CD34、CD31蛋白的表达的平均光密度和阳性面积率并进行定量分析. ⑵选取2015年9月-2017年9月于广州医科大学附属第五医院产科分娩的30例孕妇,其中25例新生儿疑患婴幼儿血管瘤,5例新生儿暂未罹患血管瘤,待胎盘娩出后,无菌条件下切取胎盘组织叶状绒毛膜部分,采用免疫组织化学法和免疫荧光法对胎盘绒毛膜组织CD133、CD34蛋白进行定性分析. ⑶使用上一步收集的无菌胎盘组织,采用酶解法联合密度梯度离心法分离培养胎盘组织细胞,应用免疫荧光法和流式细胞分选法对细胞中CD133、CD34蛋白进行定性分析,以证实胎盘组织中存在内皮祖细胞.以CD133(+)CD34(+)染色的细胞认定为内皮祖细胞. ⑷应用SPSS17软件对数据进行分析处理,各组数据以均数±标准差((x)±s)表示,对各组平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验,对阳性面积率作双变量相关分析.规定P≦0.05认为差异有统计学意义. 结果: 第一部分结果: VEGF、DLL4蛋白在婴幼儿血管瘤增生期组高表达,而在消退期组和正常皮肤组不表达,差异具有统计学意义(P<0.05),消退期组和正常皮肤组差异无统计学意义(P>0.05).VEGF和DLL4阳性面积率相关分析显示,VEGF、DLL4在增生期和消退期表达均呈正相关,VEGF:r=0.821,P=0.003;DLL4:r=0.830,P=0.003. 第二部分结果: 1、增生期血管瘤组织CD31、CD34和CD133蛋白的IOD和阳性面积率均明显高于消退期IH组织和瘤旁正常皮肤组(P均<0.05),而消退期IH组织和瘤旁正常皮肤组中CD31、CD34和CD133蛋白的IOD和阳性面积率差异无统计学意义(P均>0.05).免疫荧光染色示增生期血管瘤组织中CD34和CD133蛋白高表达,消退期血管瘤组织和正常皮肤组织低表达. 2、胎盘组织免疫组织化学染色可见滋养层细胞周环绕棕黄色颗粒,CD34和CD133蛋白具有较显著的表达,免疫荧光示CD34和CD133蛋白在胎盘组织中高表达. 3、倒置显微镜下,刚分离的单个核细胞呈圆形,细胞形态小,不均匀地悬浮分布于培养皿底部;48h后可见细胞贴壁;3d后贴壁细胞有微小集落形成,周围的细胞以集落为中心,呈发芽式向外生长,7d时,形成中央主要为圆形细胞,周围为梭形细胞的典型集落;10d时,梭形细胞出现典型的线样排列结构;相邻的细胞簇之间相互连接形成血管网样结构.培养至14d长梭形细胞逐渐缩短并逐渐变为菱形,在培养28d时贴壁细胞逐渐呈现出典型铺路石样改变. 4、细胞免疫荧光示:此法分离出的细胞中存在能同时表达CD34和CD133的内皮祖细胞;流式细胞分选法示:此方法分离培养的胎盘组织中存在CD34和CD133双标记的内皮祖细胞. 结论: 1、VEGF、DLL4在增生期血管瘤组织中呈高表达,在消退期及正常皮肤组织中低表达或不表达,并存在显著性差异,证明VEGF-DLL4/Notch信号通路可能参与IH的病理过程. 2、EPCs标志物CD34和CD133蛋白在在增生期血管瘤组织和胎盘组织中高表达,提示婴幼儿血管瘤的EPCs和胎盘组织的EPCs可能有同源性,并且是内皮细胞的前体细胞,是血管瘤的病理演变过程细胞学基础. 3、从罹患婴幼儿血管瘤患儿的母体胎盘和正常胎盘组织中可成功分离出EPCs.