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第一部分含有MYC基因结构异常的弥漫性大B细胞淋巴瘤的临床病理学研究目的:研究弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)中MYC基因结构异常的形式及其所占比例,分析MYC基因结构异常与MYC蛋白表达之间的关联,总结具有MYC基因结构异常的DLBCL病例的临床病理特征。材料与方法:收集复旦大学附属肿瘤医院2007-2011年存档的200例福尔马林固定石蜡包埋DLBCL标本制作成10×12点阵的组织微阵列(tissue microarray,TMA)。通过病史资料结合电话访问获得详细的临床资料。使用原位荧光杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)方法在福尔马林固定石蜡包埋的DLBCL组织学切片上检测MYC基因的重排和拷贝数量扩增。以免疫组织化学(IHC)进行以下抗体染色:CD10、BCL6、MUM1、Ki-67和MYC。10例扁桃体反应性淋巴组织增生作为外对照。CD10、BCL6和MUM1的染色结果根据Hans法则判定肿瘤是生发中心B细胞(germinal center B-cell, GCB)样还是非生发中心B细胞(non-germinal center B-cell, non-GCB)样免疫亚型。MYC染色结果以免疫组化评分表示:阳性细胞百分数×阳性强度等级(1、2、3分)。以扁桃体淋巴组织反应性增生的最高免疫组化评分作为评判MYC过表达的界值。结果:FISH法检测MYC异常,182例TMA标本获得可判读结果,其中17例(9.3%)有MYC基因重排,未发现MYC基因拷贝数扩增病例。10例扁桃体反应性淋巴组织增生病例MYC免疫组化评分中位值为30(范围10-60)。200例DLBCL病例MYC免疫组化评分中位值为50(范围0-270),取免疫组化评分60为界值,84例(42%) DLBCL呈现MYC蛋白过表达。有MYC基因重排的DLBCL (DLBCL, MYC+)中MYC蛋白表达水平显著高于无MYC基因重排的DLBCL (DLBCL, MYC-)(免疫组化评分中位值分别为120和40,P=0.004)。84例MYC蛋白过表达的病例中,DLBCL, MYC+有14例(17%),DLBCL, MYC-有70例(83%)。Ki-67增殖指数在DLBCL, MYC+与DLBCL, MYC-之间无显著性差异(中位值分别为80%和82.5%)。根据Hans法则分型,17例DLBCL, MYC+中11例为GCB表型,165例DLBCL, MYC-中89例为GCB表型,两组之间分布无显著差异。17例DLBCL, MYC+中,10例呈现国际预后指数(International Prognostic Index, IPI)高危(IPI>2),165例DLBCL, MYC-中,46例呈现高IPI(P= 0.008)。所有患者均接受(R)CHOP方案治疗,DLBCL, MYC+患者的生存时间显著短于DLBCL, MYC-患者。结论:DLBCL中MYC基因的结构异常形式为基因重排,后者可能和MYC蛋白过表达相关。但DLBCL中MYC蛋白的过表达并不局限于有MYC重排的病例,提示可能还有其他机制导致基因失调控。MYC基因重排能够识别临床高危的DLBCL患者。第二部分BCR信号对MYC的调控作用及生物学效应目的:研究DLBCL中B细胞受体(B-cell receptor, BCR)信号对MYC蛋白水平的调控方式和生物学效应的影响。材料与方法:[体外研究部分]选用有BCR表达的DLBCL细胞系(DLBCL, BCR+):OCI-LY8. SU-DUL-4作为实验组;选用BCR缺失的DLBCL细胞系(DLBCL, BCR-):Toledo. SU-DHL-2作为对照组。OCI-LY8为具有MYC基因重排的DLBCL细胞系。使用BCR激动剂处理DLBCL, BCR+及DLBCL, BCR-以模拟体内BCR的活化,另使用BCR的抑制剂R406以及PI3K抑制剂LY294002预先孵育各个细胞系再使用BCR激动剂处理,Western Blot检测pSYK、pAKT、 pGSK3B及MYC的表达,免疫荧光检测pSYK、pAKT及MYC的表达。RT-PCR定量检测MYC基因的mRNA水平。流式细胞仪PI-Annexin V及PI染色检测凋亡及细胞周期。CCK-8检测细胞增殖。[基于组织的研究]流式细胞法检测DLBCL细胞表面BCR的表达,筛选出DLBCL, BCR-作为实验组,DLBCL, BCR+作为对照组。免疫组织化学及Western Blot检测pSYK. pAKT及MYC的表达。结果:Western Blot显示BCR激动剂处理DLBCL, BCR+导致pSYK、pAKT、pGSK3B及MYC水平上调,pMYC水平下调,而BCR抑制剂R406及PI3K抑制剂的预处理则可以显著抵消这一效应;BCR激动剂及BCR抑制剂R406对DLBCL, BCR-的处理不影响pSYK、 pAKT、pGSK3B、pMYC及MYC的水平。免疫荧光染色显示BCR激动剂处理DLBCL, BCR+导致pSYK、pAKT及MYC上调,而BCR抑制剂R406的预处理则可以抵消这一效应;BCR激动剂及BCR抑制剂R406对DLBCL, BCR-的处理不影响pSYK、pAKT及MYC的水平。BCR激动剂处理DLBCL, BCR+,MYC基因mRNA表达水平上调,而BCR抑制剂R406的预处理则可以抵消这一效应;BCR激动剂及BCR抑制剂R406对DLBCL,BCR-的处理不影响MYC基因的mRNA水平。流式细胞仪PI-Annexin V染色显示BCR抑制剂R406的预处理可以促进DLBCL,BCR+的凋亡,而对DLBCL,BCR-无影响。流式细胞仪PI染色显示BCR抑制剂R406的预处理促使G1期细胞比例升高,而对DLBCL, BCR-无影响。细胞生长曲线显示BCR抑制剂R406能显著抑制DLBCL, BCR+而非DLBCL, BCR-的生长。免疫组织化学染色显示DLBCL, BCR-中 pSYK, pAKT及MYC的表达显著低于DLBCL, BCR+。 WesternBlot显示DLBCL, BCR-中pSYK及pAKT的相对表达量显著低于DLBCL, BCR+。结论:BCR的活化可以通过PI3K-AKT-GSK3B途径使得MYC去磷酸化,MYC蛋白降解减少,从而水平升高,另一方面,BCR也可通过促进MYC基因转录从而上调其表达水平。BCR抑制剂及PI3K抑制剂可以抑制BCR-PI3K-AKT-GSK3B的活化,下调MYC蛋白水平,并且促进凋亡、细胞周期阻滞及生长停滞。此外,DLBCL, BCR-患者因BCR-PI3K-AKT-GSK3B-MYC信号轴处于静息状态,可能无法从该通路靶向抑制剂的治疗中获益。