高血压是导致心脑血管疾病的重要诱因,已经成为了全球性的公共健康问题。血管紧张素转化酶(Angiotensin-Ⅰ converting enzyme,ACE)在血压调节过程中起到了重要的作用。近年来,利用酶解食源性蛋白获取ACE抑制肽已经被广泛报道。通过多步分离纯化是目前发掘新型ACE抑制肽的常用策略。然而,该方法存在着分离成本高、耗时费力等缺点。随着越来越多ACE抑制肽的发现,其结构特征与抑制活性间的关系也逐步被阐明。因此,基于结构信息学快速筛选ACE抑制肽的策略有助于新型ACE抑制肽的开发利用。本研究以曲拉酪蛋白作为蛋白源,首先分析了曲拉酪蛋白作为制备生物活性肽的潜能。通过对曲拉酪蛋白氨基酸种类分析发现,其中疏水性氨基酸、碱性氨基酸和芳香族氨基酸占比分别为41.9%、12.1%和8.4%。该类氨基酸为ACE抑制肽结构中的优势氨基酸。然后研究分析了曲拉酪蛋白中生物活性肽的分布,发现其中包含大量ACE抑制肽片段,总ACE抑制肽出现频次(∑AACE inhibition)为2.1632,表明曲拉酪蛋白是产ACE抑制肽的良好蛋白源。研究继续利用模拟酶切分析了单酶(嗜热菌蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)及多酶组合酶切曲拉酪蛋白产ACE抑制肽的能力。结果表明,单酶中蛋白酶K、木瓜蛋白酶和嗜热菌蛋白酶的∑AACE inhibition较高,分别为0.1750、0.1608和0.1537;多酶组合中嗜热菌蛋白酶+木瓜蛋白酶、胰蛋白酶+蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶+木瓜蛋白酶、胰蛋白酶+嗜热菌蛋白酶和木瓜蛋白酶+碱性蛋白酶的∑AACE inhibition值较高,分别为0.2856、0.2399、0.2387、0.2338 和 0.2199。采用单酶及双酶组合对曲拉酪蛋白进行实际酶解验证研究,发现曲拉酪蛋白水解物通过超滤分级后,低于3 kDa的水解物具有较强的ACE抑制活性。单酶嗜热菌蛋白酶水解物具有较强的ACE抑制活性,IC50为8.8±1.6 μg/mL。双酶嗜热菌蛋白酶+碱性蛋白酶和嗜热菌蛋白酶+蛋白酶K水解物ACE抑制活性较强,IC50为2.6±0.6 μg/mL和4.5±0.2 μg/mL。通过分析上述水解物ACE抑制活性与其模拟酶切ACE抑制肽出现频次∑ AACE inhibition之间的关系,发现嗜热菌蛋白酶呈现正相关性,而嗜热菌蛋白酶+蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶+碱性蛋白酶呈现负相关性。表明以上两组双酶组合水解物中可能含有ACE抑制活性较高的多肽片段。进一步利用Lineweaver-Burk曲线考察了水解物的ACE抑制动力学模型,发现水解物的ACE抑制动力学模型主要为混合抑制。利用LC-MS/MS鉴定了各单酶和双酶组合(嗜热菌蛋白酶+蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶+碱性蛋白酶)水解物中的多肽指纹图谱。经分析证实,水解物中包含多种已报道的ACE抑制肽片段。为进一步筛选和发掘水解物中的新型ACE抑制肽,研究利用已报道的ACE抑制肽的结构和活性,构建了能够预测多肽ACE抑制活性的定量构效关系模型。利用该模型对水解物中具有高ACE抑制潜能的多肽进行了初步筛选,共获得12条新型多肽序列。通过空间分子对接技术将上述多肽与ACE催化活性中心进行对接研究,共发现7条多肽序列能够与ACE催化活性中心成功对接。其中多肽KYIPIQ与ACE分子催化活性中心形成了最多的氢键(13条)。研究利用固相合成制备了这7条新型ACE抑制肽,结果发现这7条多肽均具有较高的ACE抑制活性。其中,多肽KYIPIQ的ACE抑制活性最高,IC50值为7.3μmol/L。该多肽存在于嗜热菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶+蛋白酶K和嗜热菌蛋白酶+碱性蛋白酶的曲拉酪蛋白水解物中。同时,ACE抑制动力学研究证明该多肽呈现竞争性抑制,表明其能够与ACE催化活性中心结合。用多肽KYIPIQ处理人脐静脉内皮细胞(HUVECs),考察新型ACE抑制肽KYIPIQ对HUVECs产血管舒张物质NO的影响,发现该多肽能够通过Akt信号通路激活一氧化氮合成酶,使HUVECs产NO能力增强。通过Caco-2细胞单层膜考察多肽KYIPIQ的转运途径发现,该多肽的转运模式为细胞旁路运输中的细胞间紧密连接途径,并能够以完整的结构跨Caco-2细胞单层膜进行转运。最后,研究通过将多肽KYIPIQ灌胃原发性高血压大鼠(SHRs)实验考察了其体内降压活性,发现该多肽在给药4 h后能够显著降低SHRs的收缩压至 162.7±6.2 mmHg。本研究基于结构信息学方法,对曲拉酪蛋白水解物中潜在的ACE抑制肽进行了快速筛选,确定曲拉酪蛋白能够作为产ACE抑制肽的良好蛋白源。并获得了一系列具有高活性的新型ACE抑制肽,揭示新型ACE抑制肽KYIPIQ的转运途径和降压作用。