研究背景BEX2（Brain Expressed X-linked gene 2）基因属于脑表达的X连锁基因家族成员。目前发现在各种组织中都有表达。该家族成员包括BEX1,BEX2,BEX3,BEX4和BEX5,它们具有高度同源性,但在表达模式、亚细胞定位和蛋白酶体降解方面存在差异。BEX2有4个变体,最长的变体有160个氨基酸。据报道,BEX2可以定位在细胞核中,与DNA结合复合体中的转录因子LMO2相互作用,该复合体识别E-box元件并促进转录。最近的研究发现,BEX2可能定位于细胞质或者线粒体。BEX2可以与线粒体蛋白TUFM结合,抑制线粒体功能。BEX2也可以与E3泛素连接酶CUL2FEMIB结合,抑制CUL2FEM1B对FNIP1的泛素化,阻止FNIP1过早降解,避免不必要的ROS积累。有文献报道,Soybean isoflavones可以诱导线粒体自噬,敲低BEX2后,Soybean isoflavones诱导的线粒体自噬减弱,但BEX2调控线粒体自噬的具体机制还不清楚。凋亡是细胞在生理和病理条件下发生的程序化死亡机制,在肿瘤的发生发展和治疗中发挥着重要作用。大多数的抗癌疗法,如化疗和放疗,可通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤,但肿瘤表现出的对化疗药物的抵抗和耐药是不可忽视的问题。因此,更好地理解肿瘤对化疗药物耐药的分子机制,有望为开发效果更好的靶向治疗药物提供理论依据。自噬是维持细胞稳态的重要降解系统,将待降解物质隔离在自噬体中,随后被运送到溶酶体。自噬的目的不是简单地清除物质,而是作为一个动态的循环系统,为细胞的更新和稳态提供新的原料和能量。自噬在代谢适应,细胞内质量控制,发育和分化过程中的更新起着至关重要的作用。自噬在肿瘤的发生发展和治疗中有双重作用。一方面,它可以通过限制细胞损伤,基因组不稳定和炎症来抑制肿瘤发生,某些自噬基因的丢失可以导致癌症。另一方面,自噬也可以帮助肿瘤细胞应对紧张的代谢环境,促进肿瘤细胞的生存。一些肿瘤依赖自噬生存和发展,并且可以利用自噬来抵抗化疗药物,导致肿瘤对化疗产生耐药性。线粒体自噬是一种通过自噬系统选择性清除受损线粒体的质量控制系统。线粒体在生理适应和细胞对环境的应激反应中起着至关重要的作用。线粒体功能障碍与许多人类疾病有关,包括衰老、癌症、神经退行性疾病。正确去除功能失调的线粒体对机体健康至关重要。PINK1-Parkin轴是介导线粒体自噬的经典通路。然而,多种肿瘤细胞中Parkin缺失,一些E3泛素连接酶如TRAF2可以替代Parkin的作用,对线粒体外膜蛋白进行泛素化。发生线粒体自噬时,NDP52和OPTN是结合底物蛋白泛素链和LC3时优先选择的自噬受体。线粒体可塑性是肿瘤发生的许多步骤的关键特征,尤其是化疗耐药。以线粒体自噬依赖的方式调节肿瘤化疗耐药的机制还需进一步探索。本课题的研究目的为:一是探究BEX2是否抑制化疗药物诱导的非小细胞肺癌细胞凋亡;二是探究BEX2调控细胞自噬和线粒体自噬的分子机制;三是探究BEX2是否通过调控自噬和线粒体自噬抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。研究方法和结果BEX2抑制化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡。抗肿瘤化疗药物Doxorubicin,Pemetrexed,Cisplatin处理细胞,Western Blot结果显示,三种化疗药物在诱导细胞凋亡的同时均能上调BEX2的表达。CCK8实验结果显示,过表达BEX2可以抑制化疗药物引起的细胞死亡,敲低BEX2可以增加细胞对化疗药物的敏感性。利用Western Blot和Hoechst33342染核实验检测细胞凋亡,结果表明,过表达BEX2能抑制化疗药物诱导的凋亡,敲低BEX2能促进化疗药物诱导的细胞凋亡。BEX2促进肿瘤细胞自噬。用自噬诱导剂Rapamycin处理细胞,发现Rapamycin诱导自噬的同时能上调BEX2的表达。通过mCherry-GFP-LC3B双荧光指示系统和Western Blot实验表明,过表达BEX2可以促进自噬,敲低BEX2可以抑制自噬。将自噬过程中的关键分子ATG5敲低后,发现BEX2促进自噬的作用被减弱。以上结果说明BEX2促进自噬流。BEX2通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进自噬。利用免疫共沉淀,GST pull down实验方法证实BEX2与PI3K的催化亚基PIK3CA存在相互作用。免疫共沉淀实验发现BEX2与PI3K的调节亚基P85竞争性结合PIK3CA。过表达BEX2,检测PI3K下游信号分子的变化,发现AKT的磷酸化水平下调,mTOR的两个底物RPS6KB1,EIF4EBP1的磷酸化水平也下调,LC3B的水平上调。过表达BEX2的同时过表达RHEBQ64L或者PIK3CA,都能减弱BEX2促进自噬的作用。以上结果提示BEX2通过与P85竞争性结合PIK3CA,抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进细胞自噬。BEX2促进线粒体自噬。线粒体分离实验发现,BEX2可以定位在线粒体上。当用线粒体自噬诱导剂CCCP处理肿瘤细胞时,BEX2在线粒体上的定位增多。mito-Keima实验和Western Blot实验显示,在过表达外源Parkin的基础上,过表达BEX2可以促进线粒体自噬,敲低BEX2可以抑制线粒体自噬。由于Parkin在大多数的肺癌细胞中表达下调,我们检测了在不过表达外源Parkin时,BEX2是否还能促进线粒体自噬。Western Blot实验显示,过表达BEX2仍然能促进线粒体自噬,敲低BEX2抑制线粒体自噬,回复实验结果显示,过表达BEX2可以重新引起线粒体自噬相关蛋白表达水平下降。上述结果说明不论Parkin表达与否,BEX2都能促进线粒体自噬。BEX2通过增强NDP52与LC3B的结合促进线粒体自噬。利用免疫共沉淀实验和免疫荧光实验证实,BEX2与自噬受体NDP52存在相互作用,且与NDP52的CC结构域结合。同时,BEX2与LC3B存在相互作用,并且通过可能的LIR结构域与LC3B结合。用CCCP诱导线粒体自噬,免疫共沉淀实验表明,敲低BEX2,NDP52与LC3B的结合能力减弱,过表达BEX2,NDP52与LC3B的结合能力增强。敲低自噬受体NDP52,BEX2促进线粒体自噬的功能减弱。以上实验表明BEX2通过增强NDP52与LC3B的结合促进线粒体自噬。巴豆酰化修饰在BEX2促进线粒体自噬和抑制细胞凋亡中起重要作用。质谱分析发现BEX2在K59位存在巴豆酰化修饰。进一步Western Blot实验证实,BEX2在K59位存在巴豆酰化而不是乙酰化修饰。免疫共沉淀和Western Blot实验显示,K59位突变后,BEX2促进NDP52与LC3B结合的能力减弱,并且BEX2促进线粒体自噬的能力也减弱。流式细胞术、Western Blot实验检测细胞凋亡发现,K59位突变后,BEX2抑制化疗药物诱导的细胞凋亡的能力减弱。BEX2通过促进自噬和线粒体自噬抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。利用流式细胞术,Wcstern Blot实验检测细胞凋亡,结果发现,敲低ATG5或ATG7,能够减弱BEX2对细胞凋亡的抑制作用。进一步通过Hoechst33342染核实验发现,自噬/线粒体自噬抑制剂Liensinine与Doxorubicin联合处理细胞,BEX2抑制细胞凋亡的能力减弱,而且敲低BEX2能增加细胞对线粒体自噬诱导剂CCCP的敏感性。敲低自噬受体NDP52,能够减弱BEX2对化疗药物诱导的细胞凋亡的抑制作用,说明BEX2通过促进NDP52依赖的线粒体自噬抑制化疗药物诱导的细胞凋亡。BEX2调控的自噬和线粒体自噬促进异种移植肿瘤生长。异种移植肿瘤实验显示,敲低BEX2能抑制肿瘤生长。稳定过表达BEX2的细胞接种在裸鼠皮下,腹腔注射化疗药物Doxorubicin,结果显示过表达BEX2能促进肿瘤生长,并且能抵抗Doxorubicin引起的肿瘤减小,BEX2巴豆酰化位点突变,减弱了 BEX2引起的肿瘤耐药。稳定过表达BEX2的细胞接种在裸鼠皮下,腹腔注射化疗药物Doxorubicin和自噬/线粒体自噬抑制剂Liensinine,结果显示Liensinine减弱了BEX2引起的肿瘤耐药。免疫组化结果显示,在肿瘤组织中,BEX2抑制Doxorubicin诱导的凋亡,Liensinine能减弱BEX2的这一作用。免疫荧光实验发现,在肿瘤组织中,BEX2促进自噬和线粒体自噬,并且促进NDP52与LC3B的共定位。BEX2在肺腺癌组织中高表达。对肺腺癌组织芯片进行BEX2的免疫组化染色,结果显示BEX2在肺腺癌组织中高表达,并且BEX2高表达与非淋巴结转移患者的不良预后相关。结论综上所述,本研究发现:1.BEX2抑制化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡;2.BEX2通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路促进细胞自噬;3.BEX2通过增强NDP52与LC3B的结合促进线粒体自噬;4.BEX2通过促进自噬和线粒体自噬抑制化疗药物诱导的细胞凋亡;5.BEX2调节的自噬和线粒体自噬促进异种移植肿瘤生长;6.BEX2在肺腺癌中表达上调,BEX2高表达与非淋巴结转移患者的不良预后相关。本课题阐明了肿瘤细胞中BEX2促进自噬和线粒体自噬的分子机制,证明BEX2通过促进自噬和线粒体自噬抑制化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡,并通过异种移植肿瘤实验证明BEX2通过调节自噬和线粒体自噬促进肿瘤生长,最后通过肺腺癌组织芯片探究了BEX2在肺腺癌组织中的表达情况,发现BEX2在肺腺癌组织中表达上调。