骨组织工程研究为肿瘤切除、创伤、先天性畸形等所致骨缺损的修复提供了新思路,其中种子细胞是核心问题之一。本研究以骨髓间充质成骨细胞为种子细胞,通过体外培养,构建出骨髓间充质成骨细胞膜片。并提出了新的骨髓间充质成骨细胞聚集体构建方法——骨髓间充质成骨细胞膜片(Bone marrow stromal osteoblast cell sheet)技术,其主要策略是提取骨髓间充质干细胞,体外扩增后,诱导为骨髓间充质成骨细胞,体外扩增纯化骨髓间充质成骨细胞,按照特定的培养程序在体外构建出骨髓间充质成骨细胞膜片,扩增的骨髓间充质成骨细胞在细胞分泌的细胞外基质表面实现三维立体生长,它的特点在于:①本研究构建的骨髓间充质成骨细胞膜片分为三层:富含基质层、中间层和富含细胞层,从而使形成的细胞膜片具有生长的动力性和方向性;②保持了扩增细胞良好的功能表型,在细胞数量增加的同时兼顾了细胞的分化能力;③良好的生物相容性和低免疫源性;④较高的种子细胞利用效率;⑤通过与天然支架材料支撑赋形,可以进行特定形态的组织构建。本研究对构建骨髓间充质成骨细胞膜片的理化性质、组织学结构和生化成分进行了分析;通过体外三维构建和动物实验评估了骨髓间充质成骨细胞膜片在体外形成骨样组织的能力和在体内形成特定形态骨样组织的能力。进而提出新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建策略,研究不同形态骨样组织的构建方法,探索新的体外构建移植体修复骨缺损的思路。实验一骨髓间充质成骨细胞膜片体外构建目的:本实验对构建骨髓间充质成骨细胞膜片组织学结构和生化成分进行了分析;通过体外三维构建评估了骨髓间充质成骨细胞膜片体外骨样组织的形成能力。方法:骨髓间充质成骨细胞膜片的体外构建:切取兔四肢长骨干骺端,通过离心分层法制备原代骨髓间充质干细胞,将原代细胞进行细胞计数并分为六等分,平均接种至六个75 cm~2培养瓶中,培养瓶底壁有80%被骨髓间充质干细胞贴满后,加入诱导液。待细胞长满皿底,消化,搜集细胞。将获取细胞高密度接种至三个九厘米直径培养皿中。孵育十四天后,观察骨髓间充质成骨细胞膜片的形成情况,并进行组织学染色和电镜观察。结果:经过体外孵育,骨髓间充质成骨细胞膜片为半透明膜状物,有弹性,内富含有质硬的白色结节,可用金属镊钳夹操作。HE染色证实有骨基质形成,并形成类似骨陷窝样的组织结构。Von kossa染色证实有矿化成分在基质中合成。观察:发现骨髓间充质成骨细胞膜片分为三层:富含基质层、中间层和富含细胞层。结论:提出骨髓间充质成骨细胞膜片的两极学说(静止极和增殖极),建立了一种新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术,骨髓间充质成骨细胞膜片是一种由骨髓间充质成骨细胞和基质(自行分泌)组成的聚集体,相信它在进一步的体外自体骨移植体的构建中具有广阔的应用价值。实验二骨髓间充质成骨细胞膜片/管状珊瑚复合体移植裸鼠皮下成骨实验研究目的:在新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术下,观察骨髓间充质成骨细胞膜片在无免疫动物体内发育成管状骨样组织的能力。方法:静态培养条件下,骨髓间充质成骨细胞膜片的静止极朝向管状天然珊瑚,将其均匀缠绕在管状珊瑚外表面,进行卷层样复合,经体外孵育4周后,观察聚集体之间的融合情况,并通过组织学染色观察组织成熟情况。最后将骨髓间充质成骨细胞膜片/珊瑚复合体植入裸鼠皮下,分为8周组、12周组,了解成骨情况。结果:大体观察,体外孵育四周后,在管状珊瑚体外周部分的骨髓间充质成骨细胞膜片卷层之间发生了组织融合,并形成了较成熟的骨样组织,而在管状珊瑚体的中央部分,有非常明显成熟的骨样组织形成。结论:在良好营养交换的环境下,骨髓间充质成骨细胞膜片具备继续成熟并发育为骨样组织的能力,调整骨髓间充质成骨细胞膜片的卷层方向(静止极和增殖极的朝向)可为骨髓间充质成骨细胞膜片的体外三维构建提供新的塑形方法。实验三骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体移植裸鼠皮下成骨实验研究目的:利用新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术,在无免疫动物体内构建出内有种植体的骨样组织,以探索骨髓间充质成骨细胞膜片体内构建带有种植体骨样组织的可行性。方法:按实验一所述方法构建出的骨髓间充质成骨细胞膜片后,以构建好的种植体/珊瑚复合体为赋形支撑体,骨髓间充质成骨细胞膜片的增殖极朝向种植体/珊瑚复合体,将其均匀缠绕在种植体/珊瑚复合体外表面。体外孵育四周后,观察聚集体之间的融合情况,最后将骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体植入裸鼠皮下,在8周后,取出标本。从大体形态、组织学结构等方面评价形成骨样组织情况。结果:通过此策略构建的骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体具有良好的生物相容性。形成的骨样组织保持着良好的初始外形,组织学结构类似于天然骨组织,含有丰富的矿化物质和胶原纤维。结论:骨髓间充质成骨细胞膜片在体内具有良好的骨样组织形成能力。形成的组织结构均匀,细胞表型维持良好,并为下一步颌骨缺损修复探索了新的方法。实验四骨髓间充质成骨细胞膜片贴附移植实验研究目的:研究骨髓间充质成骨细胞膜片贴附后成骨的构建方法。方法:按实验一所述方法构建出骨髓间充质成骨细胞膜片后,以圆片状珊瑚为支撑体,将其均匀平铺在珊瑚一面。体外短时间孵育,使骨髓间充质成骨细胞膜片与珊瑚牢靠贴附后,将构建的圆片状移植体植入细胞供体动物(新西兰兔)去除骨膜的颅骨表面。体内孵育8周、12周后,取出标本。从大体形态、组织学结构等方面了解贴附成骨情况。结果:通过上述策略,可以形成形态稳定的圆盘状骨样组织,有一定的机械性能,有大量的新骨样组织形成。结论:此策略所形成的贴附后骨样组织与膜状成骨、软骨成骨贴附移植后的情况不同。实验五骨髓间充质成骨细胞膜片修复兔颅骨极限缺损的实验研究目的:运用骨髓间充质成骨细胞膜片技术,探索在无支撑体条件下修复兔颅骨极限缺损的方法。方法:按实验一所述方法构建出骨髓间充质成骨细胞膜片。同时设自体髂骨移植的阳性对照组和单纯珊瑚材料的阴性对照组。将其分别植入兔颅骨极限缺损处,8周和12周后采用X线片,HE染色、Masson’s三色染色法等观察、比较骨缺损修复的情况。结果:组织学结构显示骨髓间充质成骨细胞膜片构建出了骨样组织。骨髓间充质成骨细胞膜片修复颅骨缺损的能力强,且与自体髂骨修复的情况相近。珊瑚组材料无成骨能力。结论:骨髓间充质成骨细胞膜片构建的组织工程骨可成为一种良好的骨缺损修复材料。实验六骨髓间充质成骨细胞膜片/种植体/珊瑚复合体修复羊下颌骨缺损的实验研究目的:利用新的骨髓间充质成骨细胞膜片构建技术,探索构建特定形态大块骨样组织的思路,并进行大动物下颌骨缺损修复。方法:以山羊为动物模型,按实验一所述方法构建出骨髓间充质成骨细胞膜片后,以珊瑚为支撑体构建山羊部分下颌骨外形,并将种植钉放入支撑材料中,用此珊瑚/种植钉作为骨髓间充质成骨细胞膜片内支撑体。骨髓间充质成骨细胞膜片的增殖极朝向支撑体,然后,将骨髓间充质成骨细胞膜片小心缠绕在内支撑体外周。进行体外孵育4周后。将此方法获得的部分下颌骨移植体植入制作好的供体动物下颌骨缺损处,12周后,取出标本,进行大体外形、组织学形态观察,了解大动物下颌骨缺损修复情况。结果:通过此策略,在内支撑体外构建的移植体具有稳定的外形,能在动物缺损部位形成理想的外形,组织学结构显示构建的骨样组织具有较好的质量。结论:骨髓间充质成骨细胞膜片加内支撑体赋形是构建特定形态骨样组织的新策略。具有较好的组织形成能力和外形稳定性,使它为大块骨缺损修复提供了新的思路。