论文部分内容阅读
背景:自身免疫性甲状腺炎（Autoimmune thyroiditis,AIT）是以个体免疫力、生活环境和家族遗传不同而引发的常见自身免疫性病,最为重要的病理改变为甲状腺组织被大量淋巴细胞充斥,在患者血清中可检测出甲状腺自身抗原的特异性抗体[1]。巨噬细胞是固有免疫系统中的组成细胞之一,当体内巨噬细胞极化失去平衡时,内环境的稳态便会发生改变[2],进而引发一系列疾病的发生发展。Notch信号通路是巨噬细胞活化的重要经典信号通路之一[3]。目前国内外尚无Notch信号通路对AIT巨噬细胞极化作用的相关报道。本研究将通过碘诱导NOD.H-2h4小鼠AIT模型和采取体外细胞阻断和过表达Notch信号的方法,探讨AIT小鼠中是否存在巨噬细胞极化的改变,Notch信号通路是否在自身免疫性甲状腺炎中过度活化以及Notch信号和巨噬细胞极化的相关性。研究方法:动物实验,将4周龄的雌性NOD.H-2h4小鼠按照随机法分为2组,对照组（Control组）和实验组（Spontaneous autoimmune thyroiditis,SAT组）,对照组喂无菌去离子水,SAT组给予0.05%碘化钠水。分别于喂养2周、4周、8周、12周和16周处死小鼠。取其甲状腺、血清、脾脏和腹腔灌洗液。记录甲状腺重量、ELISA法测定血清Tg Ab滴度、HE染色法观察甲状腺细胞淋巴的浸润程度、流式细胞术检测脾脏和腹腔巨噬细胞群分布状况。体外实验:1、取Control组和SAT组各个周龄小鼠骨髓,用集落刺激因子诱导培养,RT-PCR法检测Notch信号通路的m RNA的表达水平,Western blot法检测Notch信号通路蛋白的表达水平。2、Notch信号阻断和激活实验:4周龄雌性NOD.H-2h4小鼠随机分为2组,Control组喂无菌去离子水,SAT组给予0.05%碘化钠水,16周处死后取小鼠骨髓,种植于6孔板中,集落刺激因子诱导培养七天后,向培养液中加入不同处理因素诱导极化巨噬细胞,分为对照组、M1极化组（1、2、3组）、M2极化组（4、5、6组）。刺激24h后,用流式细胞术检测各组巨噬细胞群分布状况,Western blot法检测蛋白表达水平。对照组:+DMSO;M1极化组1:LPS+IFN-γ;M1极化组2:LPS+IFN-γ+Jagged1（Notch配体）;M1极化组3:LPS+IFN-γ+DAPT（Notch阻断剂）;M2极化组4:IL-4;M2极化组5:IL-4+Jagged1（Notch配体）;M2极化组6:IL-4+DAPT（Notch阻断剂）结果:高碘水喂养第8周、12周和16周,SAT组NOD.H-2h4小鼠甲状腺重量、血清Tg Ab水平以及甲状腺淋巴细胞浸润程度较同龄Control组有明显增高,具有统计学差异。给予碘干预2周和4周,两组小鼠相比无统计学差异。在F4/80+巨噬细胞中,在第8周、12周和16周,NOD.H-2h4小鼠（SAT组）与（Control）组相比,脾脏和腹腔M1型巨噬细胞（F4/80+CD11c+）比例明显升高,M2型巨噬细胞（F4/80+CD206+）比例明显下降,且随着喂碘水时间增长,这种改变趋势愈加突出,并具有显著的统计学意义。而经过2周和4周高碘诱导的小鼠与同时间段用无菌水喂养的对照组小鼠相比,M1型和M2型巨噬细胞的比例并无明显的上升或下降的趋势,并不具有统计学差异。在高碘水喂养第8周、12周和16周,SAT组小鼠的骨髓巨噬细胞中Notch信号相关分子Notch1、Notch3、Jagged1、Socs3、Delta1、Hey1、Hes1的m RNA表达较同龄Control组明显上升并有显著的统计学差异。而碘诱导2周和4周的SAT组小鼠并无上述变化,无统计学差异。从第8周开始,SAT组骨髓巨噬细胞中Notch信号通路关键蛋白Jagged1、Hey1、Hes1的蛋白表达均明显高于Control组并持续到16周,差异具有统计学意义。过表达和阻断Notch信号的体外实验:无论在SAT组或Control组中,在M1极化组LPS+IFN-γ+Jagged1（Notch配体）组中,Jagged1、Hey1和Hes1的蛋白表达量与M1型巨噬细胞的表达均明显高于LPS+IFN-γ组;而在LPS+IFN-γ+DAPT（Notch阻断剂）组中,Jagged1、Hey1和Hes1的蛋白表达量与M1型巨噬细胞的表达较LPS+IFN-γ组均显著下降。在M2极化组中,IL-4+Jagged1组M2型巨噬细胞的表达低于IL-4组,IL-4+DAPT组的M2型巨噬细胞的表达高于IL-4组;Jagged1、Hey1和Hes1的蛋白表达量在IL-4+Jagged1（Notch配体）组中,均高于IL-4组和IL-4+DAPT（Notch阻断剂）组。SAT组的M1/M2极化组Notch信号通路关键蛋白的表达均显著高于Control组,差异具有显著的统计学意义。结论:1、0.05%碘化钠水喂养8周后NOD.H-2h4小鼠发生自身免疫性甲状腺炎。2、自身免疫性甲状腺炎小鼠腹腔和脾脏的M1型的巨噬细胞的表达显著增高,M2型巨噬细胞的的表达显著下降。3、AIT小鼠的骨髓巨噬细胞Notch信号相关分子中,Notch1、Notch3、Jagged1、Socs3、Delta1、Hey1、Hes1的m RNA,Jagged1、Hey1、Hes1的蛋白水平,均明显高于同龄对照组,提示Notch信号通路参与自身免疫性甲状腺炎的发生发展。4、激活Notch信号通路后,小鼠骨髓M1型巨噬细胞表达增加,Jagged1、Hey1和Hes1的蛋白表达量增加,M2型巨噬细胞表达减少;抑制Notch信号通路后,M1型巨噬细胞表达减少,Jagged1、Hey1和Hes1的蛋白表达量下降,M2型巨噬细胞表达增加。提示Notch信号通路调控巨噬细胞极化参与自身免疫性甲状腺炎。