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肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophage,TAM）,作为肿瘤微环境重要的组成成分之一,与恶性肿瘤的发生,侵袭和转移密切相关。TAM主要分为M1和M2两种表型,其中具有肿瘤支持作用的通常认为是M2型TAM。很多研究表明Wnt5a主要表达于肿瘤间质中,尤其是表达在TAM中。然而,TAM的极化以及其生物功能是否受Wnt5a调控还仍然不清楚。因此本研究从临床出发,首先评估结直肠肿瘤组织中TAM,Wnt5a+TAM以及Wnt5a+TAM/TAM比值的表达差异,以及这些指标在结直肠癌中的临床预后意义。同时,我们还通过Wnt5a与M1型或M2型TAM的共定位分析以明确Wnt5a+TAM的表型。然后我们构建了TAM体外实验模型,进一步通过一系列细胞分子生物学实验和裸鼠成瘤实验研究Wnt5a调控TAM的M2极化以及促进结直肠肿瘤细胞的增殖,迁移和侵袭的具体机制。本研究主要分为以下三个部分:第一部分:Wnt5a+TAM/TAM比值与结直肠癌患者临床病理特征和预后的相关性目的:转移是癌症相关死亡的主要原因。肿瘤微环境中的TAM可通过分泌多种介质,如细胞因子、趋化因子等,抑制抗肿瘤免疫反应,刺激血管生成,最终促进癌细胞增殖、侵袭和扩散转移。虽然TAM在肿瘤转移中发挥了重要作用,但并不是所有类型的TAM都参与肿瘤的进展和转移。很多研究表明Wnt5a主要表达于肿瘤间质中,尤其是表达在TAM中。然而,在结直肠癌中Wnt5a+TAM亚型的临床意义还不清楚。方法:采用组织切片荧光免疫染色方法检测人结直肠恶性肿瘤组织标本中Wnt5a,TAM标志物（CD68）,M1型TAM标志物（HLA-DR）,M2型TAM标志物（CD163）的表达,分析CD68+TAM数,Wnt5a+TAM数,Wnt5a+TAM/TAM比值与临床病理特征和患者预后之间的相关性,以及Wnt5a与M1型TAM,M2型TAM之间的定位关系。结果:在结直肠癌患者中,高表达的Wn5a+TAM与淋巴血管浸润和TNM分期相关;Wnt5a+TAM/TAM高比值与肿瘤浸润,淋巴血管浸润,TNM分期,淋巴结转移相关。进一步预后分析表明,Wn5a+TAM高表达,Wnt5a+TAM/TAM高比值都与差的无疾病进展期（RFS）和总生存期（OS）显著相关。而CD68+TAM的表达与RFS和OS无相关性。单因素和多因素分析显示Wnt5a+TAM/TAM比值是RFS和OS的独立预后因素。此外,Wnt5a主要与M2型TAM标志物CD163共定位表达。结论:Wnt5a+TAM/TAM比值与结直肠癌患者临床病理特征和预后显著相关,且Wnt5a+TAM亚型是一种M2型的TAM。第二部分:Wnt5a调控TAM的M2极化以及促进结直肠肿瘤细胞增殖,迁移和侵袭的具体机制研究目的:TAM的极化是一个多因素、多步骤、复杂的病理过程。最近的研究表明Wnt信号在TAM的M2极化中起着重要作用。然而,是否Wnt5a也参与调控TAM的M2极化以及其生物功能还不清楚。方法:应用共培养体系构建TAM模型和一系列细胞分子生物学实验来研究Wnt5a调控TAM极化的潜在机制。进一步通过克隆形成,侵袭,迁移等实验来评估Wnt5a对TAM生物功能的影响。结果:体外模拟的TAM,即与结直肠癌肿瘤细胞共培养诱导的TAM是一种M2型的巨噬细胞,且高表达Wnt5a。Wnt5a可以诱导巨噬细胞分泌IL-10,IL-10作为自分泌细胞因子诱导这些巨噬细胞M2极化。IL-10中和性抗体完全逆转了Wnt5a对巨噬细胞的M2极化作用。进一步的机制研究表明,Wnt5a通过调控Ca KMII-ERK1/2-STAT3通路介导IL-10分泌,进而活化巨噬细胞向M2极化。此外,Wnt5a诱导的M2型巨噬细胞促进结直肠肿瘤细胞细胞增殖、迁移和侵袭,而敲低TAM中Wnt5a的表达明显抑制了TAM的肿瘤促进功能。结论:Wnt5a通过调控Ca KMII-ERK1/2-STAT3通路介导的IL-10分泌,诱导TAM向M2极化,并最终促进结直肠肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。第三部分:Wnt5a+TAM对结直肠肿瘤裸鼠皮下成瘤和转移能力的影响目的:进一步采用体内裸鼠皮下成瘤实验验证Wnt5a+TAM对结直肠肿瘤皮下成瘤和转移能力的影响以及Wnt5a对TAM生物功能的调控作用。方法:应用裸鼠皮下成瘤的模型评估Wnt5a+TAM对结直肠肿瘤生长的影响,记录肿瘤的不同时间点的体积大小,称量肿瘤的大小,进一步通过Ki-67染色分析Wnt5a+TAM对肿瘤增殖的影响;裸鼠心脏采血分离和计数循环肿瘤细胞（CTC）,收集肝肺组织进行HE染色以评估Wnt5a+TAM对结直肠肿瘤肝、肺转移能力的影响。结果:Wnt5a+TAM显著增强结直肠肿瘤体内成瘤的生长和增殖能力,增加裸鼠外周血CTC的数目,促进结直肠肿瘤的肝、肺转移;而敲低TAM中Wnt5a的表达明显抑制了Wnt5a+TAM对肿瘤生长和转移的促进作用。结论:Wnt5a+TAM在体内促进结直肠癌的生长和转移,而Wnt5a的敲除明显抑制了TAM的促癌作用。