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脑梗死急性期风火痰瘀蕴化形成火毒是病情骤变、加重恶化的转折点。火毒致病,一方面其酷烈暴戾,可引发一系列损害性因子的启动,损伤脑络,既往研究证实此过程与以炎性反应为中心环节的缺血级联损伤相吻合;另一方面,火毒之急剧加重更损伤机体正气,败坏形质。当前研究证实缺血级联损伤可导致神经血管单元结构及功能破坏、抑制血管新生。促进脑梗死后血管新生,对恢复缺血组织血氧供应,改善脑梗死后神经功能具有重要意义。miR-210为当前公认的缺氧特异性miRNA,其在缺血诱导下的血管新生中有明显促进作用,miR-210 还可调控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达从而介导血管新生。苦碟子注射液,具有清热解毒通络之功效,对急性脑梗死损伤具有保护作用,然而其是否可以调控miR-210介导VEGF/PI3K/Akt通路,从而促进血管新生呢?目前尚未阐清。本研究选取大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型,观察苦碟子注射液对急性脑梗死再灌注3天后血管新生的影响;进一步运用miR-210激动剂(miR-210 agomir)作为阳性对照,观察苦碟子注射液对miR-210的调控作用以及对miR-210介导的促血管新生信号通路的影响,明确苦碟子注射液调控急性脑梗死后血管新生的分子机制,阐明苦碟子注射液治疗急性脑梗死的关键环节和靶点,从分子层面为临床用药提供科学依据,进一步丰富祛邪扶正中医治病的整体观。[目的]建立大鼠MCAO模型,探索苦碟子注射液对大鼠缺血再灌注3天后血管新生的促进作用,通过miR-210介导VEGF/PI3K/Akt通路,寻找其作用环节和靶点;试图从血管新生角度,深化苦碟子注射液对急性脑梗死神经血管单元的保护机制,丰富祛邪扶正中医治病的整体观。[方法]1.研究一:雄性SD大鼠,8周龄,线栓法建立左侧大脑中动脉梗死模型,Zea Longa评分判定模型是否成功。实验随机分为3组:假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、苦碟子注射液组(MCAO+KDZ)。MCAO术后3天,Garcia 18分评价大鼠神经功能缺损状况;TTC染色测定脑梗死体积;免疫荧光法检测缺血皮层中微血管内皮细胞特异性标记物vWF的表达;Western blot法检测缺血皮层VEGF蛋白表达。2.研究二:雄性SD大鼠,8周龄,线栓法建立左侧大脑中动脉梗死模型,Zea Longa评分判定模型是否成功。实验随机分为6组:假手术组(Sham)、模型组(MCAO)、苦碟子注射液组(MCAO+KDZ)、agomir 阴性对照组(MCAO+miR-ctl)、miR-210 激动剂组(MCAO+miR-210)、miR-210激动剂合并苦碟子注射液治疗组(MCAO+miR-210+KDZ)。MCAO术后3天,Garcia 18分评价大鼠神经功能缺损状况;TTC染色测定脑梗死体积;荧光定量PCR法(Real Time PCR)法检测缺血皮层中miR-210含量;免疫荧光法检测缺血皮层中vWF表达;Western blot法检测缺血皮质中VEGF、VEGFR2、PI3K、Akt 蛋白表达。[结果]1.研究一:MCAO术后3天,Garcia评分显示MCAO+KDZ组较MCAO组大鼠神经功能缺损症状有显著改善(P<0.05);TTC染色显示MCAO+KDZ组脑梗死体积较MCAO组显著减少(P<0.05);vWF标记免疫荧光显示MCAO组及MCAO+KDZ组均见一定程度的内皮细胞增殖,微血管密度增加(P<0.05),且MCAO+KDZ组缺血皮质区内皮细胞增殖数量较MCAO组明显增多,微血管密度显著增加(P<0.05);Western blot显示VEGF在MCAO+KDZ中的表达较MCAO组显著增加(P<0.05)。2.研究二:MCAO术后 3 天,Real Time PCR 显示与 Sham 组比较,MCAO+KDZ、MCAO+miR-210、MCAO+miR-210+KDZ 三组中 miR-210 含量呈现上升趋势,但miR-210含量在MCAO+miR-210、MCAO+miR-210+KDZ两组间无明显统计学差异(P>0.05);Garcia 评分及 TTC 染色均显示,与 MCAO 组相比,MCAO+miR-210、MCAO+miR-210+KDZ两组神经功能评分明显增高(P<0.05),而MCAO+miR-210、MCAO+miR-210+KDZ两组比较无明显统计学差异(P>0.05);vWF标记免疫荧光显示与Sham组相比,MCAO+miR-210+KDZ组微血管密度显著增加(P<0.05);Western blot 显示,与 MCAO 组比较,VEGF/VEGFR2/PI3K/Akt 各蛋白表达在 MCAO+miR-210、MCAO+miR-210+KDZ两组均显著增加,且VEGFR2、PI3K蛋白表达在MCAO+miR-210+KDZ 中更为显著(P<0.05),而 VEGF、Akt 蛋白在 MCAO+miR-210、MCAO+miR-210+KDZ 两组间无统计学差异(P>0.05)。[结论]苦碟子注射液可改善急性脑梗死大鼠神经功能,减小脑梗死体积,促进血管内皮细胞增殖,其分子机制可能与调控miR-210介导的VEGF/PI3K/Akt信号通路有关。