目的:肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,为全球范围内恶性肿瘤致死的首要原因。中国是肺癌大国,发病率和死亡率均居全球之首,疾病负担沉重。肺癌根据组织学类型分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）两大类,其中NSCLC是一种主要的组织学类型,占比约80～85%左右。尽管手术、放化疗、靶向治疗等多种治疗方法不断发展,NSCLC晚期患者5年生存率仍不超过5%。鉴定新的早期诊断和预后标志物,更深入地了解其发病机制对于NSCLC患者的早诊及临床治疗至关重要。p53基因是目前发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,正常情况下p53好似“基因组卫士”,在细胞周期G1期检查DNA损伤点,监视基因组的完整性。如果p53基因失活,对细胞的正常增殖失去控制,导致癌症的发生。p53基因失活的机理主要包括两个方面,一是p53基因突变,二是通过与其它蛋白的相互作用而失活。虽然p53基因突变在癌症中普遍存在,但是在大多数保留野生型（WT）p53的癌症中该蛋白可以通过与其它蛋白的相互作用而失活,导致其抑癌功能丧失或降低。例如,MDM2、MDMX等E3泛素连接酶可结合p53,通过泛素化途径降解p53使其失活。研究调控p53泛素化降解的相关机制,如何恢复p53的抑癌功能,一直以来是学术界长期研究的方向之一。RBR E3泛素连接酶因包含RBR（RING-IBR-RING）结构域而得名,是近年来新被纳入泛素连接酶的一类蛋白,RBR结构域介导蛋白-蛋白相互作用。RBR E3连接酶广泛存在于真核生物中并参与转录和RNA代谢、翻译、翻译后修饰、蛋白质稳定性的调节、细胞和应激信号、细胞周期控制等都多种细胞事件。RBR E3连接酶在肿瘤的发生及发展过程中也起着重要作用,例如Parkin和RNF144A等通过泛素途径介导肿瘤促进因子或抑制因子的降解参与肺癌、乳腺癌等肿瘤的发生及进展。RNF19A属于RBR E3连接酶家族成员,具有典型的RBR三段式结构域,能独立发挥E3泛素连接酶的作用。有文献报道,RNF19A的mRNA积累表达在前列腺癌患者的血清中增加。但是,目前在NSCLC中关于该基因的功能未知,所以我们拟探索RNF19A在NSCLC中的表达情况,及其参与调控NSCLC发生及发展的作用机制,以期对NSCLC的诊断和治疗提供新思路和方向。研究方法:1.收集中国医科大学第一附属医院病理科存档的非小细胞肺癌石蜡标本136例及30例癌旁组织。免疫组化S-P法检测RNF19A蛋白在癌组织及癌旁组织中的表达差异,并分析RNF19A在癌组织中的表达与肺癌临床病理特征的相关性。另收集新鲜的NSCLC及癌旁正常组织标本8对,Western blot检测RNF19A蛋白在NSCLC组织中的表达情况。2.利用Oncomine数据库转录水平分析RNF19A mRNA在人NSCLC组织中的表达情况,GEPIA数据库在线分析RNF19A基因与NSCLC患者预后的关系。3.在p53野生型人NSCLC细胞系A549和H460中分别敲减或过表达RNF19A基因之后,MTT试验检测肺癌细胞活力,平板集落形成实验检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC染色,流式细胞仪检测细胞凋亡数目变化。明确RNF19A在NSCLC细胞中的生物学功能。4.Western blot检测RNF19A基因敲减或过表达之后p53蛋白及其下游蛋白p21、BAX、Cyclin D1、CDK4、CDK6及BCL2的表达变化。Real-time PCR检测RNF19A基因双向操作之后p53 mRNA水平的变化。确定RNF19A调控p53的下游信号通路。5.在p53基因缺失的NSCLC细胞系H1299和p53基因突变的NSCLC细胞系SK-MES-1中,敲减或过表达RNF19A基因,MTT、平板克隆形成实验检测细胞增殖能力,Annexin V-FITC染色,流式细胞技术检测细胞凋亡,初步确定RNF19A在NSCLC发挥促癌作用依赖于p53。为了进一步明确此观点,设计了挽救实验,即在转染RNF19A siRNA的基础上敲减p53基因,观察敲减RNF19A对细胞增殖抑制能力的回复情况。同时观察敲减p53对能否逆转RNF19A敲减对p53及其下游蛋白表达的影响。6.我们用蛋白酶体抑制剂MG132处理RNF19A敲减的A549和H460细胞,并通过Western blot检测p53蛋白的表达,明确RNF19A是否通过蛋白酶体途径促进p53降解。7.转染RNF19A siRNA 72h后加入CHX（放线菌酮）分别作用0、0.5、1、1.5、2、2.5h 6个时间点收集细胞,Western blot检测A549和H460细胞中内源性p53蛋白的半衰期。8.内源性和外源性免疫共沉淀实验测定RNF19A与p53蛋白是否存在相互作用。9.A549细胞中分别转染RNF19A siRNA和过表达质粒,转染后24h加入蛋白酶体抑制剂MG132处理以抑制蛋白的降解,通过泛素化实验检测细胞内源性p53的泛素化水平。检测RNF19A是否影响p53蛋白的泛素化降解。结果:1.RNF19A在NSCLC组织中高表达,与患者不良预后相关。8例新鲜的配对NSCLC组织中,RNF19A蛋白表达水平明显高于其配对的癌旁正常组织。免疫组化检测NSCLC石蜡标本及癌旁正常组织结果显示,RNF19A在NSCLC组织中高表达,并且其高表达与NSCLC肿瘤大小、TNM分期正相关。检索Oncomine数据库中的数据集,我们发现RNF19A mRNA在NSCLC组织中的表达明显高于癌旁组织。GEPIA数据库分析显示,RNF19A mRNA在NSCLC中的高表达与患者不良预后正相关。2.RNF19A促进NSCLC细胞增殖。在p53野生型细胞系A549和H460中,MTT和平板集落形成实验表明RNF19A可以促进NSCLC细胞的增殖能力。3.RNF19A抑制NSCLC细胞凋亡。Annexin V-FITC染色,流式细胞仪检测结果表明RNF19A可以抑制NSCLC细胞凋亡。4.RNF19A抑制p53蛋白的表达,调控p53的下游信号通路。Western blot实验结果显示,RNF19A抑制p53及其靶蛋白p21和BAX的表达,上调p53下游蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6、BCL2的表达。但是敲减或过表达RNF19A基因后,p53mRNA水平没有发生变化。5.RNF19A发挥促癌作用依赖于p53。RNF19A的敲低或过表达对p53缺失细胞系H1299和p53突变细胞系SK-MES-1的增殖和凋亡没有显著影响,此实验结果表明,RNF19A发挥促癌作用可能依赖于p53。为了进一步证实此观点,又设计了回复实验,我们发现,敲低p53基因不仅逆转了RNF19A敲减对细胞增殖的抑制作用,而且还逆转了对p53及其下游蛋白表达的影响。6.RNF19A与p53相互作用,促进p53泛素化。蛋白酶体抑制剂MG132挽救了RNF19A基因敲低导致的p53表达升高,此结果表明RNF19A可能通过蛋白酶体途径促进p53降解。放线菌酮（CHX）实验结果显示,RNF19A敲减细胞中的内源性p53的半衰期明显长于对照组。内源性及外源性免疫共沉淀实验证实RNF19A蛋白可以与p53蛋白相互结合。泛素化实验显示,RNF19A过表达明显诱导p53泛素化水平,而RNF19A敲低则降低了p53泛素化水平。结论:1.RNF19A作为新的促癌基因在NSCLC中高表达,且其高表达与肿瘤大小、TNM分期及不良预后有关。2.RNF19A促进NSCLC细胞增殖、抑制细胞凋亡。3.在NSCLC中,NF19A通过促进p53泛素化降解,从而抑制p53下游信号通路,进而促进NSCLC细胞增殖和抑制凋亡。因此,本研究有助于深入了解NSCLC发生发展过程中p53失活的机制,为p53野生型的NSCLC患者的诊断和靶向治疗提供了新思路。