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目的:呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是引起婴幼儿、免疫功能低下者及老年人群毛细支气管炎和肺炎的主要病原体。严重RSV感染可导致患者出现喘鸣、紫绀、呼吸困难等哮喘样症状甚至诱发急性支气管哮喘。究其原因与RSV感染诱导Th2型细胞因子分泌增多有关。肺组织内Ⅱ型固有淋巴细胞（Group2 innate lymphoid cells,ILC2s）具有堪比Th2细胞的强大的Th2型细胞因子分泌能力。在RSV诱导的气道炎症反应中,ILC2s可通过不同途径产生IL-5和IL-13等Th2型细胞因子,导致嗜酸性粒细胞浸润与气道高反应,诱发并加重气道炎症反应。然而,迄今为止,在RSV急性感染发生过程中,肺组织内ILC2s的活化调控机制尚不十分清楚。众所周知,呼吸系统高度接受来源于副交感神经系统的自主神经支配。除细胞因子与趋化因子外,神经肽和神经营养因子等神经递质亦参与气道功能的调节。近年来,神经-免疫调节在维持机体稳态中的作用日益受到关注。神经介素U（Neuromedin U,NMU）是由胆碱能神经元分泌的一种神经肽,属于神经介素家族,参与包括激活免疫细胞和诱导炎性细胞因子分泌在内的多种机体反应过程。NMU存在两种不同的结合受体:NMUR1和NMUR2,均属于G蛋白偶联受体A群。研究显示NMUR1主要表达于外周组织脏器,而NMUR2则主要表达于中枢神经系统。现已明确,在外周组织,NMU通过NMUR1发挥生物学作用。那么,在RSV急性感染发生过程中,NMU是否是介导RSV气道炎症的关键因子?何种类型细胞产生NMU?NMU对ILC2s是否具有调控作用,如何调控?NMUR1是否参与其中?诸多问题亟待解决。本研究利用RSV急性感染模型鼠,采用HE染色、免疫荧光、Real-time PCR、Werstern blot、ELISA、流式细胞术等实验方法,旨在证明在RSV诱导的急性气道炎症发生过程中,NMU调控ILC2s增殖与活化,阐明其调控机制,明确NMU来源细胞,为加深理解神经-免疫调节对病毒感染所致气道炎症反应的作用提供实验基础。方法:1.采用Real-time PCR及Western blot技术检测RSV感染后肺组织内NMU mRNA及蛋白表达水平。2.体外培养原代神经元细胞,利用Real-time PCR及Western blot技术检测神经元细胞在RSV刺激下分泌NMU情况及其TLRs表达水平;应用TLRs特异性激动剂或抑制剂,探讨RSV诱导神经元细胞分泌NMU的可能机制。3.利用重组NMU蛋白刺激或抗NMU中和抗体阻断NMU的体内实验,分析NMU在RSV气道炎症中的关键作用。采用HE染色观察肺部炎症浸润情况,收集肺泡灌洗液分类计数炎性细胞,评估肺部炎症反应;应用ELISA技术检测细胞因子表达水平;应用流式细胞术检测ILC2s的数量及活性。4.利用NMU刺激感染RSV的ILC2s,提取细胞上清及细胞内RNA,利用ELISA、Real-time PCR及流式细胞术检测炎性细胞因子的表达水平。5.利用流式细胞术分析感染RSV的模型鼠肺组织ILC2s中NMUR1的表达情况;分选ILC2s,利用Real-time PCR及Western blot法检测NMUR1的表达水平;利用免疫荧光观察NMU体外刺激ILC2s后NMUR1表达情况,进行平均荧光强度分析。6.免疫磁珠分选RSV感染鼠肺ILC2s,体外与NMU共培养,同时加入不同浓度NMUR1阻断抗体,应用流式细胞术及ELISA法检测ILC2s炎性细胞因子表达水平的变化。7.体外NMU与ILC2s共培养时加入信号通路选择性抑制剂,应用Real-time PCR检测ILC2s炎性细胞因子表达水平的变化。结果:1.Real-time PCR及Western blot检测发现BALB/c鼠感染RSV后,其肺组织内NMU mRNA及蛋白表达水平显著升高。2.分离培养原代神经元细胞,以最佳感染复数MOI:10感染RSV。Real-time PCR及Western blot技术检测发现,RSV感染导致神经元TLR4、TLR7表达水平升高;用TLR4、TLR7激动剂刺激原代神经元细胞,导致其NMU表达水平显著升高。相反,在RSV感染神经元之前给予TLR4、TLR7抑制剂,则显著抑制神经元原代细胞分泌NMU。3.重组NMU蛋白刺激加重RSV感染诱发的肺部炎症;而体内注射NMU中和抗体阻断NMU活性后,肺部炎症明显减轻。收集肺泡灌洗液分类计数炎性细胞,发现NMU刺激组炎性细胞总数增加,以淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数量上升尤为显著,而NMU阻断组肺炎症细胞呈减少趋势;ELISA法检测肺泡灌洗液炎性细胞因子表达水平,发现NMU刺激可显著提高RSV感染鼠肺泡灌洗液中Th2型细胞因子IL-5和IL-13的表达水平,而阻断NMU活性,则模型鼠肺泡灌洗液中IL-5和IL-13分泌水平明显下降。应用流式细胞术检测发现,与RSV组相比较,NMU刺激组肺ILC2s数量增多,分泌IL-5/IL-13的ILC2s百分比亦升高。与此相反,中和NMU活性导致ILC2s数量下降,其IL-5和IL-13分泌活性降低。4.免疫磁珠分选感染RSV的BALB/c鼠肺ILC2s,体外NMU刺激,结果发现,NMU刺激可明显提高ILC2s细胞因子IL-5和IL-13分泌水平5.流式细胞术分析发现感染RSV的模型鼠肺ILC2s中NMUR1的表达水平升高,并在急性感染期升高显著;分选RSV感染鼠肺ILC2s,利用Real-time PCR及Western blot技术检测发现,RSV感染导致NMUR1表达水平升高,该现象在急性感染期最为明显;利用免疫荧光观察NMU体外刺激ILC2s后其NMUR1表达情况,结果发现NMU刺激组ILC2s表达更多的NMUR1;流式细胞术检测亦提示NMU刺激可显著提高ILC2s-NMUR1的表达水平。6.免疫磁珠分选RSV感染鼠肺ILC2s,体外NMU刺激的同时加入NMUR1阻断抗体,流式细胞术及ELISA法检测发现阻断NMU结合受体NMUR1可显著降低ILC2s分泌IL-5和IL-13的能力。NMUR1阻断效果与其阻断抗体浓度呈正相关。7.利用PI3K、MEK信号蛋白选择性抑制剂抑制NMU刺激ILC2s活化的信号通路,Real-time PCR检测发现肺ILC2s的IL-5与IL-13 mRNA相对表达量下降,提示PI3K与MEK可能是NMU活化ILC2s的主要信号通路蛋白。结论:1.RSV感染促进肺内NMU的产生;2.在RSV感染模型中,神经元是NMU的主要来源细胞。神经元通过TLR4、TLR7途径应答RSV,进而分泌NMU;3.NMU通过NMUR1途径调控RSV感染后肺ILC2s的增殖与活化;4.PI3K与MEK信号蛋白在NMU调控肺ILC2s活化中发挥重要作用。