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急性妊娠脂肪肝(Acute Fatty Liver of pregnancy,AFLP)是一种常发生于妊娠晚期的妊娠性肝病疾病。其发病率虽低,但发病急骤,病情凶险,并会引起很多并发症,甚至威胁母体与胎儿的生命。它的病症特点是肝细胞脂肪浸润,肝细胞肿胀,胞浆空淡或泡状。AFLP发病机制不明确,较多研究认为AFLP与遗传缺陷和脂肪酸代谢障碍有关。AFLP的一些临床病理与生化指标变化与其它妊娠性肝病(如子痫前期,HELLP综合征等)类似,使AFLP的及时准确的临床诊断面临很大困难。故从更为基础的分子层面对AFLP病因学进行探究,寻找AFLP早期诊断分子指标有着重要的学术意义和实际价值胎盘是母体与胎儿物质循环的关键场所,拥有和胎儿相同的基因组成。胎盘由羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜构成。它的主要功能是保护胎儿发育正常。胎盘利用脂肪酸作为代谢燃料。胎盘功能异常,会引起胎儿及母体疾病的发生。目前对于AFLP的病因学分子机制研究很少。蛋白质组学研究技术在疾病和药物靶向研究及生物标志物发现中起着不可或缺重要作用。本课题利用TMT标记法Nano LC-MS/MS技术对AFLP患者胎盘样品中差异表达蛋白进行测定,并运用生物信息学方法对所得差异蛋白质可能涉及的生物过程、细胞定位、分子功能、信号途径及蛋白相互作用等进行分析,以期在蛋白分子水平更多了解与AFLP病因学相关的组织分子的变化特征和规律,为后续寻找或发现AFLP早期诊断标志物和治疗靶标的研究打下基础。1、TMT标记Nano LC-MS/MS法测定胎盘中差异蛋白本章节内容包括组织样本前处理,对蛋白的酶解效率、TMT标记效率及经高pH液相色谱分馏后全蛋白鉴定覆盖率进行验证。胎盘组织经过漂洗,蛋白提取,丙酮沉淀纯化,胰蛋白酶酶解后,经LC-MS鉴定,发现酶解效率好,无污染,肽段峰分布均匀,各组之间的肽段种类大体相同,无未酶解完全的大质荷比肽段。TMT标记后再次经LC-MS鉴定,标记峰个数完整,同位素分布正常。经高pH液相色谱分馏后Nano LC-MS/MS鉴定得到358685张肽段的MS/MS图谱,和数据库匹配到89836张图谱,共鉴定到34094种肽段。2、急性脂肪肝病人的胎盘组织差异表达蛋白分析分别从正常组和AFLP组胎盘的羊膜(Amnion,Am),叶状绒毛膜(Chorion Frondosum,CF),底蜕膜(Decidua Basalis,DB)中取材,共分为6组样本。用第一章确定的方法,TMT 6标进行Nano LC-MS/MS定量分析;所得质谱数据经Mascot搜库,共得到4494种蛋白。从羊膜中筛选出341个AFLP差异蛋白,其中62个蛋白表达上调,279个蛋白表达下调。AFLP的叶状绒毛膜中筛选出210个差异蛋白,其中73个蛋白上调,137个蛋白下调;AFLP的底蜕膜中共筛选出203个差异蛋白,其中118个蛋白上调,85个蛋白下调。选择在胎盘羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜中均出现表达差异的蛋白,即Tapasin相关蛋白(Tapasin-related protein,TAPBPL),HLA I组织相容性抗原A-1α链蛋白(HLA class I histocompatibility antigen,A-1 alpha chain,HLA-A)和膜相关磷脂酶A2蛋白(Phospholipase A2,membrane associated,PLA2G2A),进行Western blot验证分析,结果与质谱结果一致。对所得差异蛋白进行了生物信息学分析,包括生物过程、细胞组分和分子功能的富集分析,KEGG通路富集分析和PPI分析。结果显示:(1)妊娠相关蛋白如催乳素(Prolactin,PRL)和胰岛素生长因子结合蛋白(Insulin-like growth factor-binding protein,IGFBP)在羊膜中下调,在底蜕膜中上调,提示胎儿发育所需营养物质转运出现异常;(2)酰基辅酶A结合蛋白(Acyl-CoA-binding protein,ACBP)和脂肪酸结合蛋白5(Fatty acid-binding protein,epidermal,FABP5)等蛋白在羊膜与底蜕膜中的表达均发生异常,表明AFLP胎盘的总体脂肪代谢过程出现障碍,其可能间接影响PPAR信号通路、脂肪酸β氧化途径及对胆固醇和脂肪酸合成的调节;(3)叶状绒毛膜中线粒体呼吸链复合体相关酶的表达变化显著,也提示AFLP叶状绒毛膜中能量代谢异常;(4)AFLP羊膜中谷胱甘肽代谢异常,同时与自由基清除相关的蛋白表达下调,表明胎盘中自由基增加,而过多自由基可能进入母体循环,引起母体中自由基的积累;(5)在AFLP羊膜和底蜕膜中,参与糖酵解过程的蛋白酶表达也出现异常,提示AFLP胎盘糖代谢也有缺陷;(6)与机体急性反应期等相关的蛋白发生表达差异,如C反应蛋白(C-reactive protein,CRP),说明AFLP在一定时间内有应激反应,这可能是AFLP的有别于其它妊娠性肝病的特征反应;(7)AFLP胎盘细胞中锌和铁稳态相关蛋白的表达出现差异,表明铁和锌等金属离子可能累积在胎盘无法转运,影响胎儿正常发育和母体与胎儿间的代谢应答;(8)在胎盘的三层结构中发现的差异蛋白,有近一半属于外泌体蛋白,这提示胎盘外泌体产生和功能异常对母体AFLP发生可能起着关键作用。综上所述,基于TMT标记联合Nano LC-MS/MS技术定量检测技术可作为鉴定筛选AFLP胎盘组织中差异蛋白的有效方法。AFLP与母体-胎儿物质交换受限、代谢紊乱、毒性物质积累及线粒体功能障碍有关,尤其值得关注的是胎盘外泌体在AFLP发生发展过程中可能扮演重要角色。本研究从胎盘及其亚解剖结构蛋白水平初步揭示了对AFLP病因学机制具有重要潜在意义的分子变化图谱,为后续AFLP生物指标物的发现打下了基础。