研究背景骨组织工程的研究具有广阔的临床应用和产业化开发前景。然而,长期以来,对于组织工程骨及其相关组织的体内构建过程和机制缺乏客观深入的了解,严重制约着骨组织工程在临床骨缺损尤其是大段负重骨缺损修复方面的应用。骨组织工程的基本含义是指将种子细胞、合成材料或处理过的天然材料、细胞因子和基因治疗综合应用于体内的骨组织重建。其中,种子细胞是构建有活力的具备生理替代作用骨组织的基础,是组织工程骨体内外研究和临床应用的重要前提。同时,宿主自身的细胞、血管、神经及其它成份也在组织工程骨的构建过程中发挥着重要的作用——如何准确地识别这些细胞,并在体内外追踪不同细胞的分布、生长、增殖、分化和迁移等情况,对于我们研究骨组织工程的相关机制、优化临床构建理念和构建模式具有十分重要的意义。针对缺乏明确标志的各种细胞,以绿色荧光蛋白基因(GFP)或红色荧光蛋白基因(RFP)等报告基因加以修饰后,就可以在体内外有效分辨单个荧光基因修饰的细胞甚至亚细胞结构,这目前在软组织的示踪研究中十分常用。然而,骨组织或含钙生物材料由于透光性差、坚硬和／或脆性大的特性,各种常规的观测方法难以有效、准确、直观地分辨和研究骨组织或材料内部的荧光蛋白基因修饰的细胞。对此,国内外目前尚缺乏成熟的研究方案。因此,对组织工程骨原位构建修复大段骨缺损进行示踪研究,是至关重要而又极富挑战性的课题。研究目的1.通过基因修饰技术获得长期、稳定、安全表达荧光的兔骨髓间充质干细胞；2.通过两种荧光蛋白报告基因对种子细胞和宿主血管神经组织的分别修饰,探讨原位构建血管神经化组织工程骨修复股骨缺损的作用机制；3.通过两种荧光蛋白转基因小鼠对原位构建组织工程骨修复股骨大段骨缺损进行示踪研究。研究内容第一部分慢病毒载体介导的荧光蛋白报告基因对兔骨髓间充质干细胞的修饰[方法]①生产携带mRFP和eGFP基因的重组慢病毒载体(LV),测定病毒滴度；②以LV-mRFP和LV-eGFP对兔骨髓间充质干细胞(rBMSC)进行基因修饰,观察长期体外培养后rBMSC-mRFP和rBMSC-eGFP细胞的荧光基因表达的情况；③探讨基因修饰对于rBMSC-mRFP增殖与分化功能的影响。[结果]①LV-mRFP的滴度均值为5.2×10e6 TU/mL (n=5),流式细胞仪检测转染后rBMSC-mRFP的阳性百分比均值为81.1%(n=5),体外传25代(24w)后,rBMSC-mRFP的阳性百分比均值为35.4%(n=5);②LV-eGFP的滴度均值达4.6×10e6 TU/mL (n=5),流式细胞仪检测转染后rBMSC-eGFP的阳性百分比均值为93.3%(n=5),体外传25代(24w)后,rBMSC-eGFP的阳性百分比均值为85.5%(n=5);③rBMSC-mRFP和野生型rBMSC的增殖曲线在各检测时间点均无显著差异,时间和组别的交互效应也不显著(F时间×分组=2.550,P时间×分组=0.092)；④rBMSC-mRFP能够分别经成骨、成软骨和成脂诱导而出现多向分化；⑤由于缺乏特异性抗兔的流式抗体,无法用流式细胞术确定rBMSCs的细胞表面标志。[小结]本部分实验获得了携带荧光蛋白报告基因的LV-eGFP和LV-mRFP,高效转染rBMSCs后获得的rBMSC-eGFP和rBMSC-mRFP可以长期稳定表达荧光；mRFP基因的修饰对rBMSC-mRFP的增殖活性和多向分化潜能未产生明显影响。第二部分双重荧光蛋白报告基因示踪血管神经化组织工程骨的体内构建[方法]①将rBMSC-mRFP细胞复合于圆柱体p-磷酸三钙(β-TCP)生物材料中(直径8 mm×高15 mm,一侧有纵行侧槽,法国Bio-lu公司),体外培养7d后用于体内实验；②以MTT、细胞计数和半固体脱钙等技术构成的研究体系,比较负压吸附法和MagIC法两种细胞接种方法的效果；③批量生产的LV-eGFP,超高速离心浓缩后,用于体内实验,测定病毒滴度的变化；④原位构建血管神经化的组织工程骨：手术制备兔股骨15mm大段骨与骨膜缺损,骨缺损局部植入以MagIC法接种的rBMSC-mRFP与P-TCP支架的复合物,六孔微型钢板和螺钉固定；局部分离出股动静脉束及其伴行的隐神经,以浓缩后的LV-eGFP原位注射感染后,将隐神经和股动静脉束植入生物支架材料的侧槽内；⑤术后4w、8w、12w和24w,分别以X线摄片、冰冻切片观察、组织学特殊染色、定量PCR等方法探讨骨缺损修复的机制。[结果]①MagIC法与负压吸附法相比,可以将更多的rBMSC-mRFP细胞植入β-TCP材料,两种方法复合细胞的材料以MTT法检测,其OD值分别为(2.96±0.06)vs(1.01±0.02),差异有统计学意义(t=52.695,P=0.000)；以细胞计数法计数材料吸附细胞的数目,分别为(4.17±0.15)vs(1.37±0.15),差异有统计学意义(t=22.450,P=0.000)；以荧光倒置显微镜、扫描电镜、半固体脱钙+激光扫描共聚焦显微镜等技术证实,MagIC法可使细胞更有效地分布于材料之中。②-80℃冻存的病毒,解冻后的病毒滴度平均为冻存前的56.3%(n=5)；浓缩前和浓缩后的病毒滴度均值分别为3.0×10e6 TU/mL (n=5)和220×10e6TU/mL (n=5), LV-eGFP经浓缩后病毒滴度提高了73.3倍。③不同时间点X线摄片显示,术后8w材料开始降解,骨痂明显增多；术后12w骨缺损区出现愈合；术后24w时出现髓腔再通迹象。④各时间点取材的冰冻切片显示,材料球孔中的红色荧光细胞逐渐增多；术后8w球孔之间形成大量红色荧光的胶原纤维相互沟通；术后12w部分球孔逐渐融合,形成不规则片状或条索状,新生软骨中可见大量红色荧光细胞；术后24w新生骨中有大量骨基质样物质沉积,红色荧光的成骨细胞沿新生骨周边排列,红色荧光的骨细胞环绕中央的小血管呈同心圆状排列；随着骨质的成熟,荧光逐渐减弱至消失。球孔内及骨基质中可见较多呈红色荧光的细小血管；骨髓腔内可见伴行的动静脉束呈绿色荧光,脂肪组织呈现红绿荧光交织现象；在材料与周边组织的连接处,较大的血管神经束呈现明亮的绿色荧光；软骨内成骨的局部可见少量绿色荧光的神经纤维。MASSON染色、银染以及HE染色进一步验证了荧光下所见的组织。⑤定量PCR分析显示,在组织工程骨中间、组织工程骨两端和进材料血管神经束三个部位的组织中,mRFP基因表达分别为0.465±0.110、0.034±0.029和0.097±0.010,差异有统计学意义(F=43.641, P=0.000); eGFP基因表达分别为0.003±0.001、0.003±0.002和0.026±0.009,差异有统计学意义(F=4.199, P=0.028); VEGF表达分别为14.095±2.887、9.422±0.815和13.851±1.310,差异有统计学意义(F=8.728, P=0.003)。CGRP和CGRP-R的表达在组织工程骨中间>组织工程骨两端>进材料血管神经束,差异有统计学意义(P≤0.002); NK-R和VIP-R的表达具有类似趋势,差异有统计学意义(P≤0.014)。NPY和NPY-R在各组之间的表达差异无统计学意义(P>0.05)。[小结]本部分实验通过系列技术建立了荧光辅助示踪骨组织工程研究体系(fluorescence aided tracer of tissue engineered bone, FATTEB),该研究体系可在体内外对组织工程骨的构建进行客观、微观的研究。通过本部分的实验发现,种子细胞(rBMSC)的增殖分化与新生组织工程骨的成软骨、成骨、骨皮质内血管的形成、骨髓腔内细胞的来源密切相关；宿主自身植入材料的血管神经束不仅分布于侧槽中,还分支长入了新生的骨髓腔内,并有部分神经纤维分布于软骨内成骨的组织内；骨髓腔内的脂肪成份可以分别来源于rBMSC的分化或植入血管束周围附带的脂肪；种子细胞和外源血管共同构建了组织工程骨内的血管网。定量PCR结果提示组织工程骨构建过程中新生骨的不同部位,两种荧光蛋白报告基因修饰的细胞根据其分布及功能的不同而发生增殖、分化和迁移,血管新生和神经作用的相关基因在组织工程骨的成骨局部表达旺盛。第三部分利用eGFP和mRFP荧光蛋白转基因小鼠原位构建组织工程骨的初步示踪研究[方法]①FVB种系的eGFP转基因雌性小鼠,无菌获取双侧股骨骨髓细胞,以全骨髓贴壁培养法,采用小鼠间充质干细胞专用条件培养基培养细胞,3w后获得小鼠BMSC (eGFP-mBMSC);②将5×10e6的eGFP-mBMSC以MagIC法复合于圆柱型β-TCP材料(直径3mmx长5mm,自行制备纵行侧槽,法国Bio-lu公司),常规体外培养7d后用于体内实验；③FVB种系mRFP转基因雄性小鼠,以无菌1.5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,术侧下肢备皮,显微手术暴露该侧股骨,制备5mm股骨中段骨与骨膜缺损,以23G无菌注射器针头作为“髓内钉”进行内固定,观察术后小鼠大段骨与骨膜缺损模型的自身愈合情况及内固定的稳定情况。④同法制备上述小鼠骨缺损模型,然后在骨缺损处植入负载eGFP-mBMSC的β-TCP支架材料,并用丝线将材料经侧槽固定在内固定上,术后4w、8w、12w摄X线片观察小鼠的骨骼愈合情况；⑤小鼠灌注固定：以10%水合氯醛按1g/kg的剂量经腹腔麻醉小鼠,开胸,在心脏搏动状态下将导管插入主动脉内,固定导管后,剪开左心耳,依次以37℃生理盐水、37℃的4%多聚甲醛和4℃的4%多聚甲醛(pH=7.4,下同)灌注固定小鼠；取小鼠术侧股骨等组织,于4%多聚甲醛中后固定,制备冰冻切片观察；⑥定量PCR组织取材：新鲜获取mRFP小鼠原位构建的组织工程骨局部少量组织,以液氮冷冻碾碎后以Trizol法抽提mRNA,通过定量PCR检测eGFP基因。[结果]①eGFP-mBMSC与β-TCP支架材料体外复合良好,细胞增殖旺盛。②术后4个月,FVB种系mRFP转基因小鼠的5mm大段骨与骨膜缺损不能自行愈合,所用的内固定方式稳定可靠。③术后12w骨缺损区出现愈合,可见材料逐渐降解。④术后12w取材大体标本可见骨缺损区已出现完整的骨皮质；冰冻切片显示,中央残存的材料孔隙中布满细胞及胶原组织,部分孔隙已开始成骨。材料近骨髓腔一侧已有较成熟的骨皮质形成,并有大量骨性胶原深入到材料的孔隙中；材料远离骨髓腔的一侧,外周有少量肌肉及纤维组织包裹。新生软骨与新生骨中可见,红绿荧光的细胞和组织交织存在；材料中央的球孔内见到大量细胞增殖,孔壁增厚,细胞分别带有绿色荧光或红色荧光,部分细胞相互融合生长(呈现棕红色或黄色荧光),球孔中央出现红色荧光的小血管；局部新生的骨髓腔内可见大量绿色荧光的骨髓细胞成份,其中生长少量红色荧光细胞;组织工程骨内胶原增生,呈现红色荧光,胶原中散布绿色梭形或多形性荧光细胞；组织工程骨周围可见红绿荧光细胞交织形成的血管壁和肌肉组织。⑤定量PCR分析显示,在组织工程骨中间、组织工程骨两端和术侧股骨肌肉三个部位组织中,eGFP/ABL基因的表达分别为：0.436±0.036、0.140±0.038和0.098±0.024,具有显著差异(P=0.000),与荧光显微镜下观察的结果相一致。[小结]本部分实验分别以两种荧光蛋白转基因小鼠作为动物模型和种子细胞的来源,可以排除病毒介导基因转染效率和感染靶向性等因素对研究结果的干扰,更全面、客观和便捷地对组织工程骨原位修复骨缺损进行示踪研究和机制探讨。荧光蛋白转基因小鼠股骨大段骨缺损(5mm)及稳定内固定动物模型的制备,为后续进行组织工程骨原位修复的相关研究奠定了基础。本部分的研究结果初步提示：种子细胞和宿主自身的细胞组织共同参与了新生组织工程骨的形成,eGFP-mBMSC植入体内后不仅分化为软骨细胞和成骨细胞,还向肌肉、血管等组织出现多向分化。结论和展望本课题的研究初步建立了一整套从体外种子细胞与支架材料的复合到体内血管神经化组织工程骨原位构建修复大段骨缺损的荧光示踪研究体系(FATTEB)。有利于客观、微观地研究体内外组织工程骨的构建进程,为进一步探索骨组织工程的相关机制,优化组织工程骨的构建理念和构建模式提供了一个良好的研究平台。本研究建立起的MagIC接种法有助于种子细胞与多孔支架材料的体外复合,进而有利于组织工程骨的体内成骨；半固体脱钙技术有助于示踪研究体外种子细胞与支架材料的复合情况,并对体内组织工程骨早期构建的示踪研究具有应用前景；定量PCR方法的应用,为组织工程骨中各种基因的表达提供了一种敏感、有效、精确的检测手段；荧光蛋白转基因小鼠股骨大段骨缺损(5mm)及稳定内固定动物模型的制备,为后续进行组织工程骨原位修复的相关研究奠定了基础。示踪研究的初步结果提示种子细胞和宿主自身的细胞组织共同参与了组织工程骨及其相关组织的构建,在不同组织中的分布则各有侧重并呈现一定的规律性。未来的组织工程骨作为人体的一个替代性组织,必然需要与人体全身的机械运动、循环、神经和内分泌等体内大环境相协调。所以,本课题目前的研究成果在有关成骨和血管神经化问题的探讨方面,还具有进一步向纵深发展的研究空间。荧光蛋白转基因动物体内组织工程骨的原位构建研究,如果能选择更大型的、负重骨条件更接近人体的动物模型进行深入的机制研究,则必将对骨组织工程的临床应用产生深远的影响。