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一、目的内毛细胞（inner hair cell,IHC）是哺乳动物耳蜗内主要的听觉感受细胞,并能将机械刺激转化为电信号。在低等脊椎动物听觉上皮中,如龟和蛙类,其毛细胞是内在调谐的,其突触神经递质释放呈现明显的频率选择性。而哺乳动物内耳毛细胞是否存在类似内在调谐的功能特性仍然是一个值得探讨和研究的问题。最近研究发现耳蜗不同部位IHC在纤毛的数目和长度、带状突触数目、细胞膜电生理特性、Ca2+通道电生理特性、Ca2+依赖性胞吐作用和囊泡循环等与细胞结构相关的以及听觉信号传递密切相关的生理功能方面呈现出明显的差异。同时,频率选择性损伤是年龄、噪音、耳毒性药物、遗传缺陷等因素导致的感音神经性聋表现出的一种常见现象,而IHC损失是其主要原因之一,提示耳蜗不同部位的IHC的存活能力可能存在差异。这些结果均提示小鼠耳蜗IHC可能也是内在调谐的,对耳蜗不同部位IHC的基因表达模式差异性的研究是探究IHC内在调谐功能特性和机制的重要基础。而目前仍然缺乏将IHC精确地沿着耳蜗纵轴分离后进行基因表达检测与表达差异分析的研究。本研究利用已建立的显微捕获的方法收集正常成年小鼠顶回和底回游离IHC进行RNA测序（Ribonucleic acid sequencing,RNA-seq）,对其差异表达基因进行筛选分析并验证,尝试为将来耳蜗不同部位IHC表现出的结构功能以及细胞存活等差异的机制研究提供基础数据和思路。二、方法1.C57BL/6J小鼠顶、底回IHC的分离与捕获:通过耳蜗基底膜解剖,胶原酶消化和机械分离,显微捕获的步骤方法收集顶底回IHC。2.高通量测序与基因表达差异性分析:将收集的耳蜗顶、底回IHC裂解后,使用SmartSeq2的步骤进行反转录和扩增,完成RNA质控后在BGISEQ-500平台进行高通量测序。利用HISAT2与DESeq进行基因表达分析,主要筛选分析了与IHC纤毛结构功能,突触电生理,耳聋基因,细胞存活等密切相关的关键基因。3.差异基因表达验证:利用免疫化学染色的方法,对PVα、OM、Fbx32和γ-Synuclein在成年C57BL/6J小鼠以及BABLc小鼠内耳的表达同时进行验证。三、结果1.IHC的分离效率较OHC低,同时底回IHC因解剖困难分离效率较顶回底,最终捕获顶回和底回IHC各3组,每组各40个细胞。2.总共有13,908和12,915个转录本分别在顶回IHC和底回IHC中表达（FPKM≥1）,其中有689个基因表达差异超过2倍,而93.4%的DEGs在顶回IHC中上调。同时筛选发现耳聋基因在顶回和底回IHC间的表达无明显差异,而与IHC纤毛结构功能、突触电生理、细胞存活等相关的部分基因,特别是Pvalb、Prkd1、Fbxo32和Sncg,在顶回和底回IHC的表达存在差异,其中Pvalb、Fbxo32在底回IHC中表达上调,Prkd1和Sncg在顶回IHC中表达上调。3.成年C57BL/6J小鼠耳蜗基底膜免疫荧光染色结果显示PVα和Fbx32在底回IHC中表达高于顶回IHC,γ-Synuclein在底回IHC中呈现选择性表达缺失,与测序结果相符。而OM仅在OHC中高表达,在IHC中几乎不表达。OM、PVα和Fbx32的免疫组织化学染色结果与免疫荧光染色结果相似,但γ-Synuclein的免疫组织化学染色结果没有发现在底回IHC中表达缺失的现象。成年BABLc小鼠耳蜗基底膜PVα和Fbx32的免疫荧光染色结果与C57BL/6J小鼠高度一致,均在高表达于底回IHC,但是未发现γ-Synuclein在BABLc小鼠耳蜗底回IHC中呈现选择性表达缺失。四、结论1.本研究建立了成年小鼠耳蜗顶、底回IHC机械分离与显微捕获的方法,采用两次吸取捕获的方法可以减少样本受细胞碎屑和杂质的污染和干扰。2.本研究揭示了成年小鼠耳蜗不同部位的IHC具有不同的基因表达谱。3.本研究发现了CaBPs的差异表达,PVα在底回IHC中表达高于顶回IHC。4.本研究发现了细胞存活相关基因的差异表达,起保护作用的基因Sncg高表达于顶回IHC,而负调控基因Fbxo32高表达于底回IHC。5.本研究提供了C57BL/6J小鼠耳蜗不同部位IHC基因表达的基础数据,可以为耳蜗不同部位IHC的结构功能以及细胞存活等差异的机制研究提供思路。