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原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第五位最常见的恶性肿瘤,在全世界肿瘤患者的致死率中高居第三位。在我国,由于乙肝病毒(HBV)的高感染率而导致慢性肝病、肝硬化、肝癌的高发性。肝炎-肝纤维化／硬化-肝癌是慢性肝病的代表性不良发展过程,早期肝纤维化具有可逆转性,早期诊断和治疗可阻断其向肝硬化方向发展；同样,早期HCC若得到及时手术治疗,可显著提高五年生存率。目前用于HCC高危人群筛查的指标主要是血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)检测及超声检查。但两者在HCC早期诊断中均存在灵敏度不高的缺陷。筛选用于HCC早期诊断和随访的敏感性标志物仍然面临着巨大的挑战,寻求新的灵敏度和特异性更高的非创性血清标志物,对于提高HCC诊断效率,疗效监控以及预后评估均具有至关重要的意义。异常糖基化与细胞的恶性转化相关。大多数N-糖蛋白由肝脏或B淋巴细胞合成,血清中N-糖组分的改变可以反映肝脏和B淋巴细胞的生理功能变化。因此,异常糖基化的数量及质量上的变化有望成为慢性肝病早期非创性诊断的依据。基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DSA-FACE).基质辅助激光解吸离子化飞行质谱(MALDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)以及凝集素微阵列(lectin microarray)等技术的发展为我们提供了快速,高灵敏度和高通量的N-糖组图谱检测手段,使血清N-糖链检测运用于临床诊断和随访成为可能。本研究从大样本临床病例和二乙基亚硝胺(diethylinitrosamine, DENA)诱导的大鼠肝癌模型两个方面探讨了N-糖组分析在HCC早期诊断中的价值。第一部分：乙肝相关肝纤维化和肝癌大样本临床病例N-糖组学研究本研究从N-糖组分析入手,评估N-糖链以及N-糖链相关的多指标联合诊断模型在肝纤维化和HCC鉴别诊断及随访中的价值。我们采用DSA-FACE的方法,检测了393例研究对象(128例乙肝相关的肝纤维化,145例HCC和120例正常对照)以及HCC切除手术前后10对随访病例的血清N-糖组图谱,比较肝纤维化、HCC状态下其特征性改变,并分析各峰值的差异。应用logistics回归法建立了基于N-糖标志物的多参数联合诊断模型,并用ROC曲线评估各指标的诊断效力。结果发现,两个N-糖链结构(NG1A2F, Peak 4和NA3Fb, Peak 9)可作为HCC的特异性诊断标志物。Log(p9/p4)在鉴别肝纤维化和肝癌时,可以达到与AFP近似的诊断效力。N-糖标志物与AFP的联合诊断模型Cscore B在鉴别诊断肝纤维化和HCC时,诊断效力较单独使用AFP提高了7-10%。N-糖标志物log(p9/p4)在鉴别早期和晚期HCC时,与单独使用AFP相比,其检测特异性提高了16%,准确度提高了8%。N-糖标志物对于HCC的诊断效力在手术前后的HCC随访病例中得到了验证。结论：N-糖链log(p9/p4)有望成为新的HCC诊断标志物；N-糖标志物与AFP联合诊断模型可显著提高HCC的诊断效力,并可用于HCC进展的动态监测和疗效评价。第二部分：DENA诱导的大鼠肝癌模型N-糖组学动态研究本研究采用DENA腹腔注射的方法建立大鼠肝癌模型,并利用此模型研究N-糖组图谱在肝癌发生发展过程中的动态变化。用DSA-FACE的方法检测了DENA诱导后肝脏病变不同发展阶段的大鼠血清,及血清免疫球蛋白的N-糖组图谱,并首次将DSA-FACE技术应用于肝脏组织蛋白的N-糖组检测。研究发现,两个岩藻糖基化修饰的两天线N-糖链(R5a和R5b)在肝纤维化-肝硬化-HCC的发展过程中逐渐升高,而另一个无岩藻糖修饰的两天线N-糖链(P5)则显著下降。与正常对照相比,log(R5a/P1)和log(R5b/P1)在HCC组中显著升高,在肝纤维化和肝硬化组中则无显著性差异,可以作为肝癌的特异性标志物。经抗肿瘤药物farnesylthiosalicyclic acid(FTS)治疗后,血清N-糖链标志物[P5, R5a, R5b, log(R5a/Pl), log(R5b/P1)]水平均恢复到DENA处理前的状态,提示血清N-糖链标志物可有效监测抗肿瘤药物FTS的治疗效果。大鼠肝脏组织蛋白N-糖组分析发现R5b随着肝脏疾病状态的加重而升高,提示N-糖链R5b来源于肝脏细胞,进一步证实血清中其丰度的改变可直接反映肝脏细胞的病变。除DSA-FACE进行N-糖链分析外,本研究采用糖蛋白染色、凝集素印迹以及实时荧光定量PCR等方法,探讨了肝脏病变中血清N-糖组变化的机制。研究发现α-1,6-核心岩藻糖基化蛋白水平在HCC大鼠的血清及肝脏组织中均有显著提高,证实了异常岩藻糖基化作用的增强与HCC的发生相关。结合糖基化修饰过程的关键代谢酶,如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和岩藻糖基转移酶的mRNA定量分析,初步阐明了肝脏病变过程中异常糖基化的分子机制。结论：在DENA-诱导的大鼠肝癌模型中,N-糖标志物可用来动态监测HCC的进展过程,并可用来评估抗肿瘤药物的治疗效果；异常核心岩藻糖基化与肝细胞恶性转化有着密切关系。综上所述,通过本课题的研究,我们发现异常岩藻糖基化与HCC的发生发展密切相关；N-糖作为特异性肝癌标志物在原发性肝细胞癌早期诊断、动态监测、疗效评价中具有潜在的应用前景；多指标联合诊断模型可显著提高诊断效力,有望成为一种新的无创性肝癌早期诊断模型。