农杆菌介导大豆高效遗传转化系统的研究

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大豆是一种重要的油料作物,是植物蛋白及油脂的重要来源,在我国广泛种植。通过基因工程的方法对大豆进行有目的改良,是一种较常规育种更为有效、快速的方法,是现代生物技术在生产实践中的具体应用。但大豆较其他作物在遗传转化操作技术的某些方面的难度大一些,主要体现在转化后植株再生频率低,转化效率低及重复性差等方面。建立理想的、高效的大豆转化体系,是国内外学者们的研究热点之一。 农杆菌介导的转化方法是植物基因工程中较为常用的方法之一,在利用农杆菌介导的遗传转化技术中,有许多因素对转化效率和转基因植株的再生都产生重要影响,对这些因素进行研究具有重要的应用价值。本论文对大豆子叶节经器官发生途径诱导丛生芽的几个重要影响因素进行了研究,同时对与农杆菌介导转化大豆频率有关的影响因子进行了优化,改善了转化条件,提高了转化频率,建立了一种转化效率高、稳定性好、通用性强的大豆转化技术体系。 获得的主要结果有如下几个方面: 1.不同激素种类和浓度的诱导培养基,对大豆子叶节丛生芽的诱导频率不同,其中诱导培养基MSB +4 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA及MSB +2 mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA +1 mg/L KT具有较好的诱导效果。 2.在相同的培养基和激素浓度条件下,不同基因型大豆之间的诱导频率具有较大差异,其中以“吉林30”、“吉林47”和“美引一号”丛生芽诱导率较高,适于作为大豆转化的受体材料。 3.不同基因型的大豆对农杆菌菌株EHA101的敏感性不同,“吉农DG3256”、“美引一号”、“吉农D9513”三个品种对农杆菌菌株EHA101具有较强的敏感性。 4.在农杆菌介导的大豆遗传转化过程中,在共体培养基中分别加入2mg/L AgNO3或2mg/L的脯氨酸,可明显提高大豆的转化率。 5.农杆菌的生长时期不同,其侵染效果也不同,试验发现生长到对数后期时的农杆菌(OD600≈0.7左右)具有较强的侵染能力,较适用于转化。 6.在农杆菌转化的过程中,外植体发育的不同阶段和生理状态对农杆茵具有不同 的敏感性,在转化前对外植体进行预培养可以调整细胞状态而有利于农杆菌的侵 染,试验发现经预培养3天后的外植体具有良好的感受态。 7.合适的侵染时间在农杆菌介导法转化大豆中,对转化率具有较大的影响,试验 表明,侵染时间为 26 min时较适宜用于大豆的遗传转化。 8.超声波辅助农杆菌转化法[SAAT(sonicated assisted Agrobacterlum-mediated transformation)],是一种对农杆菌介导转化方法的新的辅助手段,本实验发现超声 波对以大豆子叶节为受体的转化体系不具有明显的效果。
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