目前，对植物Ca²⁺信号系统各组分(Ca²⁺、CaM和CaMBPs等)的研究不断取得更为深入的成果。在植物细胞内鉴定了许多CaM调节或结合的靶酶或靶蛋白（CaBMPs），并证明它们在Ca²⁺-CaM信号转导途径中发挥重要作用，参与了许多生命活动过程。我室多年的研究证实植物细胞外也普遍存在CaM，并且可能作为一种多功能肽类信使在植物生长发育过程中发挥重要作用。这已成为植物钙调素研究的最新进展之一。 我室在对植物细胞外CaM的研究过程中，发现细胞外还可能存在CaMBPs，并首次从白芷悬浮培养细胞外纯化了一种依赖Ca²⁺的、分子量约为21kD的细胞外CaMBP（Tang等，1996）（定名为：ECBP21）。生理实验初步表明ECBP21影响白芷悬浮培养细胞的增殖（毛国红等，1999）。这些生物化学和生理学实验，仅为细胞外CaMBPs的存在及可能的功能提供了初步证据。为了进一步利用分子生物学手段证实细胞外ECBP21真实存在，并进一步研究其生物学功能，本实验从克隆基因入手进行了以下工作： 1．ECBP21全长cDNA克隆：将纯化的ECBP21蛋白经SDS—PAGE分离后电转移到PVDF膜上，氨基酸测序获得N-末端20个氨基酸序列；根据N-末端8个氨基酸序列合成兼并性引物，通过RT-PCR和5’-RACE方法，获得其cDNA序列。Northern blot分析表明克隆的cDNA序列为全长cDNA。ECBP21 cDNA全长947bp，编码216个氨基酸，序列分析显示其N端1-25氨基酸为信号肽，26-216氨基酸为成熟蛋白肽段，并且不具有跨膜结构域。将此cDNA成熟蛋白编码区核苷酸片断构建到pET-28b（+）表达载体，在大肠杆菌表达系统中诱导了该蛋白的表达，经CaM-gel overlay检测证实表达蛋白具有Ca²⁺依赖的CaM结合特性，从而进一步证实了ECBP21为一种Ca²⁺依赖的CaMBP。通过缺失表达分析实验证实CaMBD结构域位于ECBP21的羧基端。Southern blot检测表明白芷基因组中可能存在两个ECBP21基因拷贝。从而首次克隆并鉴定了一个细胞外CaMBP的全长cDNA。 2．ECBP21亚细胞定位：以重组ECBP21蛋白为抗原制备了特异性抗体。利用特异性抗体通过免疫金标定位研究表明ECBP21主要分布于细胞壁。进一步利用GFP荧光标记，通过瞬时表达方法研究显示转ECBP21-GFP毛国红:白芷细胞外钙调素结合蛋白（ECBPZI）cDNA克隆及鉴定融合基因细胞的细胞壁上有较强绿色荧光，而转缺失信号肤的乙去乙岁苍介分户融合基因及贷尹基因的细胞中，细胞壁上无绿色荧光，表明ECBP21是一种主动分泌到细胞外的分泌蛋白。由此进一步证实ECBP21确为一种质外体多肤。本实验为细胞外CaMBPS的存在提供了直接证据。 3.ECBP21表达分析:Northern blot分析表明:在白芷悬浮培养细胞生长周期中，ECBP21和CaM都为组成型表达，0一12天ECBP21表达量逐渐增加，第12天达到最高，随后12一21天，ECBP21表达量稍有下降，维持在一个比较稳定状态;而O一6天时，CaM表达量逐渐上升，第6一9天达到最大表达量，随后，9一21天，CaM表达量有所下降。表明ECBP21可能参与白芷悬浮培养细胞生长周期调控。热激、渗透、盐胁迫及JA处理时，ECBPZI表达量下降，而6一BA、ABA及GA3处理时，不影响ECBPZI的表达。推测ECBP21还可能与逆境胁迫相关。 4.初步开展了转基因研究:为了进一步确定ECBP21在植物生长发育过程中的作用，构建了ECBP21植物表达二元载体，通过真空渗透法转化了拟南芥并获得了转基因植株。表型观察仍在进行之中。 总之，通过上述研究我们首次克隆及鉴定了一种细胞外CaMBP （EC即21） CDNA，并首次提供了细胞外存在CaMBPS的直接证据。本实验结果也为利用分子生物学方法研究ECBP21的生物学功能奠定了基础，并将有助于阐明胞外 CaM的作用机制及丰富植物质外体多肤的研究。