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细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)和育性恢复(Restoration of fertility)是植物中广泛存在的一种核质互作现象。CMS由线粒体编码的不育基因(CMS genes)所编码蛋白质造成,表现为植物无法形成正常的花粉。综合多种证据,CMS的形成可以归结于花粉的发育在时间或空间上的异常,最终表现为花粉的功能缺失。CMS的恢复由核编码的恢复基因(restorer of fertility genes,Rf gene)完成,目前已有多个恢复基因完成图位克隆。例如红莲型CMS的Rf5和Rf6等多个恢复基因都属于PPR (pentatricopeptide repeats)基因家族。恢复基因编码的PPR蛋白在RNA水平上加工CMS基因共转录本,或在蛋白质水平上抑制CMS基因的翻译,使CMS基因无法正常翻译,从而恢复育性。除恢复育性的功能外,PPR基因的功能多种多样,几乎贯穿细胞内基因的复制、转录、编辑、剪切和翻译全过程,这些功能的本质在于结合RNA后行使不同的功能。目前有假说认为PPR基因功能的多样性很可能属于PPR基因召集的其他因子。我们的研究旨在深入探究红莲型CMS恢复基因Rf5的恢复机理,以及复合体成员RCF2(Restoration Complex Factor2)的功能,我们得到以下结果：1.确定RF5在恢复材料中的存在形式,我们将RF5近等基因系(后文简称为NIL)线粒体总蛋白依照分子量分离,再将分离后的蛋白质样品与红莲型不育系YtA的线粒体RNA孵育,然后通过Northern检测孵育后orfH79的构成情况,结果证实RF5存在于恢复复合体(Restoration of fertility complex, RFC)中,并且在体外重现了RF5恢复复合体加工CMS共转录本的事件；2.将RF5互作的4个候选基因进行了转基因干涉,发现其中Rcf2被干涉后,TO代转基因植株的花粉育性受到了影响,定量PCR证明在Rcf2在转基因株系受到不同程度的抑制；RCF2i-1的T1群体中有接近半数的植株花粉碘染率为50%,其余植株花粉碘染率为100%,但在RCF2i-1回交NIL的后代中花粉碘染率相比NIL并未有明显的改变,说明半不育的性状不依靠雌性生殖细胞遗传,加上T1群体中全可育材料和半可育材料比例为1：1,完全符合配子体不育遗传形式；发现干涉效果明显的材料中出现了atp-orfH79共转录本的积累,自交群体中部分的单株出现CMS共转录本和蛋白质的积累,这一证据表明RCF2的抑制影响了花粉的育性且符合红莲型CMS的配子体遗传模式,RCF2很可能是RFC中的一个互作因子；3.通过序列比对、进化分析,我们确定Rcf2编码V型ATPase中的a亚基,相比日本晴的等位基因有个别碱基、氨基酸替换,与水稻中另外两个同源基因的遗传距离较远。不同于已发现的V型ATPase各个亚基,水稻原生质体瞬时表达亚细胞定位表明Rcf2编码蛋白在可育和不育材料中均定位于线粒体,并且定位信号保留在肽段的N端；进一步使用ProteinaseK处理完整线粒体和膜系统沉淀物表明,RCF2非紧密结合于线粒体的内膜。免疫共沉淀(co-ip)、体外互作实验(pull-down)和Far Western证明RCF2与RF5有相互作用,并且RCF2也与GRP162存在相互作用,说明RCF2通过与RF5、GRP162相互作用,在内膜上形成RFC。通过V型ATPase的特异抑制剂Concanamycin A处理NIL材料,发现atp6-orfH79随着处理时间的增加而积累,并且处理时间延长会有ORFH79的蛋白质积累,说明RCF2的V-ATPase a亚基活性对于RFC的活性十分重要；将Rcf2RNAi的T2代种子诱导愈伤,提取线粒体后发现,接近半数的个体线粒体中没有GRP162的积累,结合GRP162在YtA线粒体中的几乎没有积累,而GRP162融合线粒体导肽后可以恢复育性,我们推测RCF2在RFC中很可能负责协助GRP162进入线粒体,待GRP162进入后组成蛋白质复合体共同完成atp6-orfH79的加工,避免ORFH79的积累,完成花粉育性的恢复。