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背景与目的:目前,肺癌已经成为威胁人类健康最重要的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌所有病例的80%以上。尽管以手术、放疗、化疗等为主的治疗方式近年来发展迅速,但由于肺癌患者常发生远处转移,目前肺癌患者的5年生存率只有15%左右。近来研究表明,肺癌的发生、发展及免疫治疗效果不佳均与肺癌细胞的免疫耐受(immune tolerance)密切相关,但至今对免疫耐受发生的机制尚不完全清楚。吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是人类机体肝脏以外唯一的色氨酸代谢限速酶,其活性的强弱与免疫T细胞功能之间的关系极为密切。近来研究发现,在人类多种恶性肿瘤局部,该酶表达明显增强,严重影响肿瘤局部的免疫功能,是肿瘤细胞产生免疫逃逸的重要原因,但其作用机制尚不完全清楚。本研究首先观察IDO在NSCLC中的表达和调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)在NSCLC组织和转移淋巴结内的分布,探讨IDO表达与Treg细胞之间可能的相互关系;然后,将IDO基因转染到小鼠Lewis肺癌细胞,观察IDO基因表达对Lewis肺癌细胞生物学行为的影响,再与小鼠外周血T细胞共同培养,体外研究IDO基因表达对Treg细胞的诱导增殖作用以及对Lewis肺癌细胞迁移能力和侵袭能力的调控作用;最后,体内研究IDO基因转染对小鼠Treg细胞的诱导增殖作用及对Lewis肺癌细胞成瘤性、侵袭和转移能力的影响,最后,利用IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)研究对Treg细胞诱导增殖逆转作用,并对其机制进行初步探讨。方法:收集在第三军医大学附属新桥医院和西南医院手术治疗的62例患者肺癌组织和瘤周正常肺组织、以及15例肺良性病变组织的新鲜标本和石蜡切片。采用免疫组织化学SP法和荧光半定量RT-PCR方法检测IDO蛋白和mRNA在肺癌组织、瘤周正常肺组织和肺良性病变组织中的表达,并利用免疫组化SP法检测Treg细胞在上述各种组织内的分布情况;之后,采用阳离子脂质体Lipofectmine2000,将含人全长IDO基因的pEGFP-IDO真核表达质粒转染到小鼠Lewis肺癌细胞,G418筛选获得Lewis-IDO细胞,同时设置空白对照组(Lewis细胞)及空质粒转染组(Lewis-EGFP细胞),利用transwell侵袭小室,检测三种细胞在形态学和侵袭力等生物学行为方面的区别;再将Lewis-IDO、Lewis-EGFP和Lewis肺癌细胞分别与小鼠T淋巴细胞混合培养,利用流式细胞技术分析三种细胞对Treg细胞的诱导增殖作用;最后将三种细胞分别种植到C57小鼠,检测小鼠外周血和种植瘤中Treg细胞的增殖、种植瘤和转移灶的形成,1-MT通过加入小鼠饮用水中的方式发挥作用,通过对小鼠种植瘤内IDO基因表达和Treg细胞增殖检测验证对肿瘤局部免疫耐受的调控作用。结果:1、肺癌组织、瘤周正常肺组织和肺良性病变组织中IDO表达阳性率分别为67.7% (42/62)、0和13.3% (2/15),前者与后二者比较有显著统计学差异(P <0.01),转移淋巴结内IDO表达阳性率为75.0%(15/20),荧光半定量RT-PCR结果与免疫组化基本一致;肺癌组织、转移淋巴结、瘤周正常肺组织和肺良性病变组织中Treg细胞阳性率分别为83.9%(52/62)、90.0%(18/20)、0和13.3%(2/15),前二者与后二者相互比较有非常显著统计学差异(P <0.01),前二者之间或后二者之间相比较差异无明显统计学意义(P >0.05),IDO阳性表达率与Treg细胞阳性率之间具有非常显著相关性(P <0.01)。2、IDO基因成功转染到小鼠Lewis肺癌细胞,与Lewis-EGFP细胞和Lewis细胞相比,Lewis-IDO细胞贴壁比例增加,形态变为长梭形,伪足明显增多延长,前二者形态相似;Lewis-IDO细胞侵袭能力增强,破坏matrigel基质蛋白胶层进入下室内的细胞数明显增多,Lewis-IDO、Lewis-EGFP及Lewis细胞分别为237.4±22.1、166.0±14.2和185.6±19.5,前者与后二者比较具有显著统计学意义(P <0.05);Lewis-IDO细胞与小鼠T淋巴细胞共培养后,Treg细胞增殖明显,与Lewis-EGFP细胞(6.2±0.36)%vs(5.0±0.52)%,)及Lewis细胞(6.2±0.36)%vs(4.9±0.4)%相比统计学差异显著(P<0.05)。3、15只种植Lewis-IDO细胞的小鼠发生肝肺转移的小鼠数量及转移灶为12只和44个转移灶,种植Lewis-EGFP及Lewis细胞的小鼠分别为5只7个转移灶及4只7个转移灶,前者与后二者比较具有显著统计学意义(P=0.01);流式分析结果表明,种植Lewis-IDO细胞的小鼠外周血中Treg细胞比例明显高于Lewis-EGFP细胞组和Lewis细胞组,其比例分别为(13.7±4.5)%、(8.9±3.3)%和(9.2±3.4)%,前者与后二者比较具有显著统计学差异(P <0.05);从平均存活时间来看,种植Lewis-IDO、Lewis-EGFP和Lewis细胞的小鼠平均存活时间分别为(37.1±2.3)天、(45.1±2.6)天和(44.9±2.9)天,前者与后二者比较统计学差异显著(P <0.05),后二者之间无显著统计学差异(P >0.05);4、采用1-MT干预后,和种植Lewis-IDO细胞的未干预组小鼠比较,干预组IDO表达明显减弱,发生肝肺转移较Lewis-IDO未干预组明显减少,二者相比具有显著统计学意义(P =0.05);干预组小鼠外周血淋巴细胞中Treg细胞比例(9.7±4.0)%与Lewis-IDO未干预组(13.7±4.5)%比较明显减少(P <0.05),干预组小鼠平均存活时间为(42.0±2.3)天,与Lewis-IDO未干预组(37.1±2.3)天相比有增加的趋势,但没有显著统计学意义(P >0.05);结论:1、NSCLC组织内IDO基因表达明显增强,同时伴有Treg细胞在NSCLC组织和转移淋巴结内的增殖,且Treg细胞的分布与IDO表达呈正相关,提示IDO基因在NSCLC表达增强可能诱导Treg细胞在肿瘤局部的增殖,从而诱导NSCLC的免疫耐受。2、IDO基因转染Lewis肺癌细胞可以在体内外诱导Treg细胞增殖,同时可以增强Lewis肺癌细胞的侵袭和转移能力,提示IDO可以作为逆转NSCLC免疫耐受和抑制NSCLC侵袭转移新的治疗靶点。3、1-MT干预可以明显减少Lewis-IDO细胞的转移及Treg细胞的增殖,但不能完全抑制IDO基因的表达及延长实验小鼠的平均存活时间,故有必要寻找更有效更特异抑制IDO基因表达的方法;