目的:人类免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus type1,HIV-1）是一种能够导致人类获得性免疫缺陷综合症（Acquired immune deficiency syndrome,AIDS）的逆转录病毒。自1981年发现首例感染者,艾滋病已在在全球范围内广泛传播,严重危害人类的健康。HIV早期感染是指感染HIV病毒约6个月内,HIV从感染局部淋巴结向全身播散,血浆中病毒载量迅速攀升至10⁶-10⁷的高水平,此后下降并长期维持在稳定水平,即病毒调定点（setpoint）。病毒调定点被认为是反映HIV感染者进展速度的关键指标。HIV早期感染以病毒高水平复制,宿主强烈的抗病毒反应及免疫损伤为特点,此时期病毒与宿主的相互作用情况决定了此后的病情进展速度,因此对HIV早期感染的研究有助于我们深入理解宿主的抗病毒反应机制,为寻找潜在的抗病毒治疗靶点及疾病进展标志物提供科学依据。环状RNA（Circular RNAs,circRNAs）是一类新的非编码RNA,与传统线性RNA不同,它们以共价结合的闭合环状形式存在。circRNAs表达丰度高、稳定存在,在细胞、组织和疾病中有一定的特异性。随着芯片及RNA-seq等高通量检测circRNAs技术的发展,circRNAs被发现在多种疾病和生理病理过程中发挥重要作用,包括在一些病毒感染中发挥调节作用。Xiang Li等研究发现,成熟的环形RNA可与NF90/NF110结合形成circRNP,在抗病毒过程中发挥重要的免疫功能,且无论内源的环形RNA还是人工构建的circRNAs都具有这种结合NF90/NF110发挥功能的潜力。对乙肝病毒感染相关肝癌的研究发现circRNA-100338能够作为其诊断的潜在生物标志物和治疗靶点,并且能与miR-141-3p发挥调控癌症转移的作用。迄今,circRNAs在HIV中的作用尚不明确,但以上研究为circRNAs在HIV感染中发挥重要作用提供了有力的依据,circRNAs在HIV中的作用还有广阔的未知需要继续探索。circRNAs可通过多种机制发挥调节作用,包括作为miRNAs海绵、作为RNA结合蛋白的海绵、作为转录和翻译调节因子,此外还可与线性剪切发生竞争影响mRNAs表达水平。其中circRNAs作为miRNAs海绵是最早发现也是迄今为止最重要的功能。circRNAs结合并捕获特定miRNAs,抑制其发挥作用,这种现象也称为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）假说。CircRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络越来越受到重视,并已在阿尔茨海默症、肺癌、乳腺癌等疾病中发现其存在的证据。目前,尚无对HIV感染的全基因组水平的circRNAs及ceRNA分析。HIV-1基因组包括结构蛋白基因（gag,env,pol）及辅助蛋白编码基因（nef,tat,rev,vif,vpu和vpr）,HIV复制包括以下主要步骤:首先HIV病毒附着在靶细胞上,病毒进入靶细胞内、随后病毒RNA逆转录成cDNA、cDNA进入细胞核、整合到宿主基因组上、进行基因转录和翻译蛋白、蛋白组装,最后释放出病毒颗粒,而病毒本身只能编码15种蛋白,复制过程需要多种宿主蛋白的参与才能完成,同时也受一些宿主限制因子,如APOBEC3G、TRIM5α、MX2、BST2、SAMHD1,一些miRNAs,如miR-198、miR-17/92等以及lncRNAs,如NEAT1和NRON的调节。尽管已有一些miRNAs及lncRNAs调控HIV复制的研究报道,circRNAs在HIV中的作用,特别是对于HIV复制的影响尚不明确。HIV与宿主细胞相互作用机制的研究对于揭示HIV的致病机理,鉴定新的抗病毒药物靶点,开发高效抗病毒药物和检测生物标志物具有重要意义。研究方法1.研究对象:RNA-seq和miRNA-seq研究包括3例未经抗病毒治疗的HIV早期感染者和3例健康对照者。差异mRNAs、circRNAs和miRNAs的qRT-PCR验证共包括30例未治疗HIV早期感染者及14例健康对照者。CD4+T细胞分选包括7例未经抗病毒治疗的HIV慢性感染者及4例健康对照者。以上标本均来自于中国医科大学附属第一医院。本研究获得伦理批准及全部参与者签署的知情同意书。2.RNA及文库质控采用Ficoll密度梯度离心法提取全血PBMC,应用胎牛血清和10%DMSO置于液氮中冻存至提取RNA。利用TRIzol提取总RNA,并应用TurboDNase去除DNA,使用NanoDrop ND-2000仪测量每个样品的RNA浓度及其纯度。以OD260/OD280值作为RNA纯度指标。RNA的完整性和gDNA污染的检测则采用变性琼脂糖凝胶电泳。使用BioAnalyzer 2100仪器进行文库质控和定量。3.RNA测序首先利用总RNA完成RNA测序文库的制备,使用RiboMinus?将总RNA中的rRNAs移除。然后使用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit预处理RNA,构建测序文库。在Illumina HiSeq测序仪上进行测序。4.miRNA测序首先利用总RNA完成miRNA测序文库的制备,主要包括以下5个步骤:1)3’接头连接;2)5’接头连接;3)反转录成cDNA;4)PCR扩增;5)回收¹50 bp的PCR扩增片段,随后在Illumina HiSeq测序仪上进行测序。5.差异表达的mRNAs的GO和KEGG分析对于差异表达的mRNAs的GO和KEGG分析采用DAVID 6.8数据库,P值小于0.05被认为有显著性差异。6.ceRNA调控网络构建TargetScan用于预测miRNAs结合种子序列位点,共有相同miRNAs的circRNAs和mRNAs结合位点代表circRNA-miRNA-mRNA相互作用。Cytoscape软件（v3.5.1）用于展示ceRNA网络。7.CD4+T淋巴细胞绝对计数用负压采血管（EDTA抗凝）采集研究对象外周血5ml,取20μl CD3/CD4/CD8混合染料加入到流式管中,再将50μl全血加入,室温避光染色15分钟,加入免洗溶血素450μl,室温避光15分钟,FACS Calibur流式细胞仪进行检测,计算CD3+/CD4+,CD3+/CD8+T淋巴细胞绝对数量8.病毒载量检测取1ml EDTA抗凝血浆,采用COBAS^?AmpliPrep/cobas^?TaqMan^?System自动载量仪上,以实时定量PCR方法测定病毒载量。全部操作按照说明书进行,检测范围为20-10⁷拷贝/ml,低于20的结果显示为<20拷贝/ml。9.逆转录和荧光实时定量PCR使用TRIzol reagent（Life Technologies）提取总RNA,MiRNeasy Micro Kit（QIAGEN）提取miRNAs,用DNaseI（QIAGEN）去除DNA污染,总RNA逆转录使用Primpscript^? RT reagent kit（TAKARA）试剂盒,miRNA逆转录使用Mir-X^TM miRNA First Strand Synthesis Kit（TAKARA）试剂盒,使用LightCycler480荧光定量PCR仪（Roche公司）及SYBR^?Premix Ex Taq^TMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TAKARA）进行qRT-PCR定量,采用GAPDH作为circRNAs定量的内参,RPLP0作为mRNAs定量的内参,U6作为miRNAs定量内参。相对定量法(^2-△△Ct法)计算circRNAs,mRNAs和miRNAs的相对表达。10.原代细胞分选密度梯度离心法提取外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）,采用BD FACS Aria Ⅱ流式细胞仪分选以CD3（Percp）,CD4（APC-cy7）,两种抗体将CD4+T细胞（CD3+/CD4+）从PBMC中分选出来,使用流式细胞仪LSR Ⅱ进行细胞纯度分析。11.细胞培养及转染siRNA293T细胞培养采用含有10%胎牛血清,1%青链霉素的DMEM培养液,JURKAT细胞及原代细胞培养采用含有10%胎牛血清,1%青链霉素的RPMI 1640培养液。所有细胞均在37℃、5%CO₂的细胞培养箱培养。采用汉恒生物科技有限公司合成的siRNA si-hsa_circ₀003863,转染siRNA试剂为Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher）,48h收集细胞,qRT-PCR检测si-hsa_circ₀003863敲减效率。12.HIV假病毒制备质粒提取:按质粒大提说明书提取NL4-3△ENV-luc和VSV-G质粒,转染前一天,将293T细胞铺板于100mm培养皿上,待细胞密度长致70%时进行转染,转染前一个小时将培养基吸去,换成1640培养基,将共10μg的质粒（NL4-3△ENV-luc:VSV-G=2:1）和jetPRIME转染试剂混合,滴加于细胞上,48h后收集细胞上清。13.HIV假病毒感染si-RNA下调hsa_circ₀003863的293及JURKAT细胞应用制备好的HIV假病毒,感染用siRNA敲减hsa_circ₀003863 48h的JURKAT细胞及293T细胞,48h后收集JURKAT细胞上清检测HIV P24抗原,收集293T细胞提取DNA,进行Alu-gag two-step PCR及检测HIV 2-LTR cycle。14.Alu-gag two-step PCR及HIV-1 2-LTR检测使用Alu-gag two-step PCR检测整合的HIV DNA,qRT-PCR检测HIV-1 2-LTR来检测未整合的HIV DNA。15.HIV P24抗原检测收集感染HIV假病毒的敲减hsa_circ₀003863 48h的JURKAT上清,利用ELISA试剂盒检测上清的HIV P24抗原含量。通过绘制标准曲线,乘以稀释倍数,计算上清P24浓度。16.统计分析GraphPad Prism软件用于进行统计分析和制图,circRNAs,mRNAs和miRNAs相对表达水平的比较采用非参数Mann-Whitney U检验,siRNA敲减后细胞上清中P24的浓度及HIV整合和未整合HIV DNA的比较采用t检验,用Spearman相关系数分析各变量之间的相关性,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.HIV早期感染者PBMC中差异表达的mRNAs和circRNAs从3名未治疗HIV早期感染者和3名健康对照者PBMC的RNA-Seq数据中共鉴定出20,315个mRNAs转录本,其中2049个差异表达的mRNAs,包括673个在HIV早期感染中上调的mRNAs和1376个下调的mRNAs。同时鉴定出15,145个circRNAs转录本,共获得1365个差异表达的circRNAs,包括912个上调的circRNAs和453个下调的circRNAs。2.HIV早期感染者PBMC中差异表达的miRNAs应用miRNA-seq技术对RNA-seq同一批标本进行了HIV早期感染miRNAs差异表达谱的研究。共测得1304个miRNAs,发现30个在HIV早期感染中差异表达的miRNAs,其中上调的miRNAs 12个,下调的miRNAs 18个。3.HIV早期感染mRNAs,circRNAs和miRNAs差异表达准确性验证随机从差异表达的mRNAs,circRNAs和miRNAs中选择了4个mRNAs,4个circRNAs和4个miRNAs进行qRT-PCR验证。结果显示,扩大标本例数后,这些差异表达的mRNAs,miRNAs的相对表达水平与RNA-seq表达情况一致,且具有显著性差异（P<0.05）,而选择的4个差异表达的circRNAs中,有3个表达水平与RNA-seq表达情况一致,且具有显著性差异（P<0.05）,另有一个变化趋势与RNA-seq表达情况一致,但结果没有显著性差异（P>0.05）,该结果证明通过RNA-seq获得的mRNAs和circRNAs差异表达谱和miRNA-seq获得的miRNAs差异表达谱的可靠性。4.差异表达的circRNAs特征差异表达的circRNAs分布在22个常染色体和X、Y染色体上。CircRNAs按种类分成5大类,包括正向circRNAs、内含子circRNAs、基因间circRNAs、外显子circRNAs及反向circRNAs,构成比分别为8.42%（115/1365）,3.08%（42/1365）,0.37%（5/1365）,88.06%（1202/1365）和0.07%（1/1365）。89.30%（1219/1365）的cirRNAs的长度为小于2000 nt,中位长度为超过500 nt。在每个circRNAs类别和长度分组中,上调的circRNAs的数量均大于下调的circRNAs的数量。5.HIV早期感染中ceRNA调控网络的构建根据ceRNA假说,构建了包含差异表达的mRNAs,circRNAs和miRNAs的ceRNA调控网络。ceRNA网络共包含516个差异的circRNAs,21个差异miRNAs和903个差异mRNAs。按ceRNA调控原理,将ceRNA网络分为两部分,一个包含366个上调的circRNAs,14个下调的miRNAs,378个上调mRNAs;另一个包括150个下调的circRNAs,7个上调的miRNAs,525个下调的mRNAs。6.HIV早期感染中ceRNA调控网络的生物信息学分析对参与到ceRNA网络构建的903个差异的mRNAs进行Gene oncology（GO）分析及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析。GO分析显示前十个富集的生物学过程分别为免疫反应、炎症反应、对脂多糖反应、干扰素γ调节信号通路、正向调节NF-κB入核、病毒防御防御、I型干扰素信号途径、负向调节细胞周期向G1/S转变和T细胞共刺激。上述生物学过程多已报道与HIV感染密切相关,特别是免疫反应,炎症反应和病毒防御反应已被证明在HIV早期感染发挥重要作用。7.环状RNA hsa_circ₀003863的发现通过对ceRNA网络的分析,发现hsa_circ₀003863变化倍数较高,且hsa_circ₀003863潜在可以调控的靶基因包括多个在HIV中已经报道过发挥重要作用的基因,如IL-15,CD38,TNFSF10,RAC1等。8.环状RNA hsa_circ₀003863的鉴定为了进一步确认hsa_circ₀003863为circRNAs,而非其对应的线性mRNAs,我们为hsa_circ₀003863设计包含其环化位点的背靠背引物（即使上游引物和下游引物是呈背靠背反方向扩增）,对扩增产物进行Sanger测序,测序结果确定扩增产物的环化位点及环化位点前后序列与circBase数据库中的信息一致,说明测得的hsa_circ₀003863结果真实可信。9.hsa-circ₀003863在HIV早期感染中的表达情况选取18例未治疗HIV早期感染者和9例健康对照者对hsa-circ₀00386在HIV早期感染中的表达情况进行qRT-PCR验证,实验结果显示hsa-circ₀003863在18例HIV早期感染者PBMC中的表达量显著高于9例健康对照者（P<0.05）,与转录组测序结果相符合。10.HIV感染者hsa_circ₀003863表达水平与病毒调定点水平有关在未接受抗病毒治疗时,病毒调定点是决定HIV感染疾病进展的重要指标。对18例未治疗HIV早期感染者进行随访,将患者按病毒调定点分为setpoint<4和setpoint>4两组,setpoint点高组hsa_circ₀003863表达量显著高于低组（P<0.05）,结果提示hsa_circ₀00386表达能够预测疾病进展。11.HIV早期感染者hsa_circ₀003863表达水平能够预测CD4+T细胞下降HIV感染者CD4+T细胞下降的速度是判断其疾病进展的关键因素,kaplan-meier生存分析hsa_circ₀003863的表达水平与CD4+T细胞的绝对计数下降到500 cells/μl的关系,发现HIV感染者hsa_circ₀003863表达水平能够预测CD4+T细胞下降。12.hsa-circ₀003863在CD4⁺T细胞中的表达量与病毒载量呈正相关我们将HIV病毒攻击的主要靶细胞CD4⁺T细胞通过流式细胞术分选出来,qRT-PCR并检测hsa-circ₀003863的表达量,实验发现,hsa-circ₀003863在CD4⁺T细胞中的表达量与病毒载量（viral load,VL）呈正相关（P<0.05）。13.hsa-circ₀003863影响HIV病毒复制在JURKAT细胞中,用siRNA下调hsa-circ₀003863后,感染NL4-3假病毒收集感染后48小时的上清检测HIV P24抗原,结果表明JURKAT细胞在下调hsa-circ₀003863 48小时后出现HIV P24抗原水平的显著下降。在293T细胞中,用siRNA下调hsa-circ₀003863后感染NL4-3假病毒收集感染后48小时的细胞提取DNA,做Alu-gag two-step PCR及qRT-PCR检测HIV-1 2LTR。Alu-gag two-step PCR结果表明293T细胞在下调hsa-circ₀003863 48小时后HIV整合的cDNA下降,提示hsa-circ₀003863可能影响了病毒复制的整合阶段。结论:1.HIV早期感染者的PBMC中存在circRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络,且circRNAs可能参与多种HIV早期感染的致病过程。2.HIV感染者hsa_circ₀003863表达水平与病毒复制水平呈正相关,且能预测CD4⁺T细胞数量下降。3.hsa-circ₀003863可能通过影响HIV的整合阶段调控HIV复制。