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由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致的乙型肝炎是一种严重危害人类健康的传染病,不仅在世界范围内感染人数众多,而且容易发展成为肝硬化和肝癌。虽然乙肝疫苗的成功应用使新发的HBV感染数量有所下降,但目前全世界仍有3.5亿慢性乙肝病毒感染者,核苷类似物和干扰素或许可以使部分患者的血清学指标转阴,但不能彻底清除肝细胞内部的病毒。相对于HCV和其他一些嗜肝病毒来说,目前人们还没有找到一种可以彻底治愈HBV感染的办法。为了研究HBV的感染致病机制和研发防治药物,人们迫切需要构建一个合适的动物模型,但由于HBV有明显的嗜肝性,且宿主范围狭窄,体外培养困难,使HBV动物模型的选择方面受到了很大限制。近年来,人们尝试建立了多种HBV动物模型,如大鼠、树鼩、人-小鼠嵌合肝模型等,但均有各自的不足,其中一个共同的缺点即是,无法模拟人体对HBV感染产生特异性的免疫应答。人类白细胞抗原(HLA)的高度多态性是造成宿主感染HBV的结局异同的主要原因。我们前期的GWAS研究结果表明,HLA的DRB1*0803等位可能在慢性乙型肝炎的感染过程中起到了保护作用。为了进一步研究HLA-DRB1*0803的保护效应及遗传免疫学机制,我们拟构建HLA-DRB1*0803转基因人源化免疫小鼠模型。本研究构建了包含小鼠MHC-II类分子组织特异性表达调控元件的HLA-DRB1*0803转基因载体,并在体外和体内分别进行了表达功能验证和转基因鼠模型构建。实验方法:提取WATANABE细胞(基因型为DRB1*0803纯合子)的总RNA,逆转录得到cDNA,PCR扩增出DRB1*0803基因片段。在NCBI上查找到小鼠Eαpromoter和兔β-globin的基因序列,用重叠PCR的方法化学合成。将上述3段基因按顺序连接到p BR002-lacz载体上。测序验证无误后,成功构建表达载体HLA-DRB1*0803。使用Lipofectamine 2000转染试剂盒将该载体转染至小鼠DCS细胞和B细胞系,用Western Blot和免疫荧光的方法对目的蛋白进行检测。用T细胞增殖的方法检测该载体转染后的细胞是否可以将抗原递呈给人的T细胞,启动MHC-Ⅱ类限制性的CD4+Th1反应。用XbaⅠ内切酶切开质粒环,将含有目的基因的片段采用显微注射的方法注射入FVB/N品系小鼠的受精卵内,制备F0代DRB1*0803转基因小鼠,剪尾提取DNA后用PCR的方法进行筛选。结果:1.经全自动序列分析仪测序验证,成功扩增、克隆了人类HLA-DRB1*0803基因,构建了HLA-DRB1*0803表达载体。2.经HLA-DRB1*0803转基因载体转染后,小鼠DCS细胞和B细胞系的Western Blot分析结果均表达出了大小约为29KDa的目的蛋白。3.免疫荧光结果表明,转染后DCS细胞的胞浆和胞膜上可见特异性蛋白表达。4.T细胞增殖实验表明,转染后的小鼠DCS细胞可将负载的HBc Ag递呈给人的T细胞,产生特异的T细胞免疫应答。5.筛选出了2只基因组内携带有人类HLA-DRB1*0803基因的founder小鼠。结论:成功构建了HLA-DRB1*0803转基因载体,该载体可以在细胞水平特异性表达HLA-DRB1*0803基因,并具有抗原递呈功能。用该载体制备的转基因小鼠携带有人类HLA-DRB1*0803等位基因。