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目的探讨miR-665-3p通过靶向ATG5介导的自噬调节在小鼠真菌性角膜炎中的作用。方法1.筛选目标miRNA并初步证实自噬通量作用:首先,建立小鼠茄病镰刀菌性角膜炎模型,采用基因芯片分析感染角膜组织差异表达的miR-665-3p,并用q PCR验证;多种生物信息学软件预测miR-665-3p的靶基因,并选择ATG5为目标基因;Western blot和双荧光素酶法在体外培养的小鼠原代角膜基质细胞中验证miR-665-3p对ATG5的调控作用;透射电子显微镜观察感染角膜组织中自噬小体形态;Western blot检测自噬相关蛋白LC3B、P62的表达。2.细胞实验:体外培养小鼠原代角膜基质细胞,并分为7组:感染组（control组）、自噬抑制组（CQ组）、自噬激活组1（Rapa1组）、自噬激活组2（Rapa2组）、miRNA对照组（miR-NTC组）、miR-665-3p antagomir组（Ant-665组）和miR-665-3p agomir（miR-665组）。分别用50u M氯喹处理CQ组12h,100nM雷帕霉素处理Rapa1组2h,1uM雷帕霉素处理Rapa2组2h,100nM miR-NTC处理miR-NTC组48h,100nM miR-665-3p antagomir处理ant-665组48h,miR-665-3p agomir处理miR-665组48h。各组加药并按上述时间处理后,均用茄病镰刀菌感染6小时（MOI=3）,提取细胞蛋白,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B、P62蛋白的表达情况;自噬双标腺病毒共定位法检测细胞中LC3B及溶酶体;荧光显微镜观察细胞中自噬蛋白ATG5、P62的表达情况。3.动物实验:建立小鼠茄病镰刀菌性角膜炎模型,分为6组:感染组（control组）、自噬抑制组（CQ组）、自噬激活组（Rapa组）、miRNA对照组（miR-NTC组）、miR-665-3p antagomir组（Ant-665组）和miR-665-3p agomir（miR-665组）。后5组分别予结膜下注射7ul的50u M CQ、1uM Rapa、100nM miR-NTC、100nM miR-665-3p antagomir和100nM miR-665-3p agomir,1h后用改良表层镜法建立小鼠茄病镰刀菌角膜炎模型。分别于感染后1、3、5、7天裂隙灯显微镜下观察角膜病变特点并对溃疡面积、浑浊程度、溃疡形态进行临床评分;HE染色观察角膜组织的病理变化;自噬双标病毒共定位检测LC3B及溶酶体;免疫荧光显微镜观察角膜组织自噬蛋白ATG5、P62的表达情况;Western blot检测角膜自噬相关蛋白LC3B、P62、ATG5,炎症相关蛋白IL-1β和凋亡相关蛋白Caspase3的表达情况。结果1.基因芯片结果提示miR-665-3p在真菌性角膜炎中上调表达,并经过qPCR验证（P<0.05）。多种生物信息学软件提示ATG5是miR-665-3p的作用靶点之一。Western blot验证miR-665-3P对ATG5具有负调控作用（P<0.05）;荧光素酶报告系统证实miR-665-3p与ATG5的3’UTR存在直接的结合位点（P<0.001）;透射电镜发现相对于对照组小鼠,实验组小鼠角膜中自噬小体体积更大,且包含更多受损的细胞器;Western blot检测结果发现LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白在1-5天表达明显减少,而p62蛋白表达均增多（P均<0.05）,且在第5天最为明显,提示真菌性角膜炎中自噬通量受损。2.细胞实验Western blot结果发现:与对照组相比,CQ组LC3B-Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白明显增多;Rapa组和ant-665组的LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白增多,而P62蛋白减少;miR-665组的LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白减少,而P62蛋白增多（P均<0.05）。自噬双标病毒共定位检测结果提示:CQ组、miR-665组细胞里黄色或红色斑点较对照组减少,而Rapa组、Ant-665组较细胞里黄色或红色斑点对照组增多。免疫荧光的结果发现:ATG5蛋白在CQ组、miR-665组表达的荧光强度减弱,在Rapa组、Ant-665组表达荧光强度增强;P62蛋白在CQ组、miR-665组表达的荧光强度增强,而在Rapa组、Ant-665组表达的荧光强度减弱。3.动物实验裂隙灯观察发现:与对照组相比,CQ、Rapa组和Ant-665组的角膜水肿程度降低、混浊程度、混浊面积均减少,临床评分降低;而miR-665组病理损害较重,水肿程度、混浊程度、混浊面积较对照组加重,临床评分较高（n=5）。HE染色结果显示:与对照组相比,CQ组、Rapa组角膜组织完整性尚有缺损,基质层空泡数较少,浸润的炎性细胞较少;Ant-665组角膜上皮层存在,基质层可见少量空泡,浸润的炎性细胞较少,细胞排列较紧密整齐;而miR-665组可见上皮全层缺损,基质层细胞排列紊乱,可见大量的炎性细胞浸润全层。自噬双标病毒共定位检测结果显示:CQ组、miR-665组黄色荧光条带（斑点聚合）减弱,而Rapa组、Ant-665组黄色荧光条带（斑点聚合）增强;免疫荧光检测结果发现:P62蛋白的荧光在CQ组、miR-665组的表达增强,而在Rapa组、Ant-665组里表达减弱;ATG5蛋白的荧光在CQ组、miR-665组的表达减弱,而在Rapa组、Ant-665组里表达增强。Western blot结果显示:与对照组相比,CQ组和miR-665组LC3B-Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白表达增加,ATG5表达减少。Rapa组和Ant-665组的P62蛋白表达减少,而LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ATG5蛋白表达增加;CQ组、Rapa组和Ant-665组的炎症相关蛋白IL-1β和凋亡相关蛋白Caspase3表达降低,而miR-665组的炎症相关蛋白IL-1β和凋亡相关蛋白Caspase3表达升高（P均<0.05）。结论1.真菌性角膜炎中自噬通量受损;miR-665-3p负调控ATG5的表达。2.miR-665-3p通过靶向ATG5参与真菌角膜炎中的自噬调节;抑制miR-665-3p的表达可增强真菌性角膜炎的自噬活性,降低炎症反应和细胞凋亡。